基于Micro-CT成像對肝癌原位移植瘤血管三維結(jié)構(gòu)的定量研究

劉巧遇 李若坤

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的發(fā)病率和致死率高[1]。血管生成是肝癌的標志，為肝癌的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)。抗血管生成是治療肝癌重要手段之一，以索拉非尼為代表的多種抗肝癌血管生成藥物已應(yīng)用于臨床[2]。為評估抗血管生成治療效果，需對腫瘤功能血管進行可視化和定量表征。組織病理學等常規(guī)方法只能展示腫瘤血管的二維結(jié)構(gòu)[3]，無法對血管分支、長度或卷曲度等進行全體積評估，因此，需尋求能更準確定量肝癌血管特征的有效方法。小動物成像Micro-CT具有高的空間分辨率，可對復雜血管結(jié)構(gòu)進行立體成像和結(jié)構(gòu)定量分析，全面展示血管三維結(jié)構(gòu)特征并完整評估腫瘤血管樹[4]。

本研究建立肝癌裸鼠原位移植瘤模型，利用Micro-CT聯(lián)合定量分析量化腫瘤血管三維結(jié)構(gòu)特征，從不同的角度展示肝癌血管生成特點，為進一步明確抑制腫瘤血液供應(yīng)的潛在途徑提供新的思路。

資料與方法

一、實驗動物

SPF級Balb/c裸小鼠，雄性，4～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，共20只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗操作與飼養(yǎng)嚴格無菌。

二、實驗方法

(一)原位肝癌動物模型建立 裸鼠隨機分為肝癌組(n=10)和正常對照組(n=10)。肝癌組采用MHCC97H人肝癌細胞株進行建模。首先于裸鼠左側(cè)腋窩建立皮下移植瘤，4周后無菌條件下取出腫瘤，去除壞死組織，修剪成1 mm×1 mm×1 mm瘤塊，移植入裸鼠肝表面，縫合肝包膜和皮膚，于無菌動物房內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)[5]。正常對照組于肝臟內(nèi)注射同等量0.9%氯化鈉溶液。操作結(jié)束后繼續(xù)飼養(yǎng)21 d。

(二)Micro-CT血管成像 (1)血管鑄型：腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.01 mL/g)麻醉裸鼠，隨后注射3 mL肝素鈉溶液(1250 U/mL)，將裸鼠仰臥位固定于固定板上，做胸腹長縱形切口，剪破橫膈，暴露腫瘤、心臟及升主動脈根部，絲線結(jié)扎左、右上腔靜脈及下腔靜脈近心端，左心室做小切口，將26G留置針軟管經(jīng)左心室插管至升主動脈口，確認插管及灌注流速滿意后絲線固定導管，離斷下腔靜脈遠心端，經(jīng)導管灌注肝素鈉生理鹽水20 mL(50 U/mL)，速率2 mL/min，經(jīng)下腔靜脈切口引流，可見肝臟由紅褐色轉(zhuǎn)為淺黃色，操作結(jié)束后再以4%甲醛5 mL進行血管內(nèi)灌注固定。新鮮配置Microfli血管造影劑(美國Flow Tech公司)，容量5.6 mL，注射速率0.5 ml/min，經(jīng)導管灌注至肝臟及腫瘤表面微血管造影劑充填呈小樹枝狀。操作結(jié)束后將標本置于4 ℃冰箱冷藏12 h后剝離裸鼠肝臟。(2)Micro-CT掃描：采用Quamtum GX Micro-CT。將肝臟鑄型標本固定于掃描架上，進行360度環(huán)形掃描。掃描參數(shù)如下：管電壓 90 KV；管電流 88 mA；FOV 36 mm×25 mm；空間分辨率50 μm；掃描時間 14 min；成像矩陣：512512。

(三)圖像分析 (1)腫瘤分割：采用最大密度投影(MIP)、容積再現(xiàn)技術(shù)(VR)重建血管圖像。利用mricron軟件(v4.0)對Micro-CT獲得的圖像進行分割，于橫斷面上逐層勾畫腫瘤邊緣，利用mevislab軟件(v3.3)分割腫瘤與背景肝臟，獲得單獨的腫瘤影像。(2)血管分割：使用閾值法和區(qū)域生長法分割出血管結(jié)構(gòu)。利用影像的灰度直方圖，將閾值設(shè)置為4600(±50)用于區(qū)別血管與背景，閾值設(shè)置為3500(±100)用于區(qū)別肝臟組織與背景。閾值處理后，使用26-鄰域區(qū)域生長法獲取連通的血管結(jié)構(gòu)和肝組織結(jié)構(gòu)。(3)血管中心線提取：在分割結(jié)果的基礎(chǔ)上，使用Matlab(R2019a)實現(xiàn)算法[5]。(4)網(wǎng)絡(luò)化：通過計算中心線上各個點之間的鄰接關(guān)系，將三維空間上的點映射到二維鄰接圖(graph)上。(5)量化特征計算：①血管計數(shù)類特征：統(tǒng)計血管與組織在影像上的體素個數(shù)，可得血管體積與組織體積，血管占比即為血管體積與組織體積之比。利用中心線圖進行搜索可得血管分支數(shù)及分支長度，這些計數(shù)與組織體積的比值可得血管結(jié)構(gòu)的血管分支密度；②血管形態(tài)類特征：為了定量血管局部形態(tài)變化，計算血管彎曲度特征 Distance Factor (DF)和Sum of angles metric (SOAM)。DF可直觀的反映血管的彎曲程度，DF值越大，該血管分支的彎曲程度越大。Bullitt等[6]首次提出了SOAM方法來定量三維血管的彎曲程度，SOAM能從局部出發(fā)，反映血管的彎曲程度。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0進行統(tǒng)計學分析。比較肝癌與正常肝臟血管的定量參數(shù)差異，符合正態(tài)性的參數(shù)選用兩獨立樣本t檢驗，否則采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、血管三維結(jié)構(gòu)

20只裸鼠均完成建模，1只正常對照組裸鼠灌注失敗，共有10只肝癌組和9只對照組裸鼠完成實驗研究。

結(jié)果顯示，正常肝臟血管呈小樹枝狀分叉，分布均勻，走行自然。腫瘤組織血管分布雜亂無章，形態(tài)無規(guī)則，部分為不規(guī)則的囊狀擴張，部分為樹枝狀分支，部分血管異常彎曲，腫瘤血管呈團、呈簇形成復雜的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。腫瘤周圍可見豐富、扭曲的血管包繞腫瘤，并由外向內(nèi)滲透性生長，腫瘤內(nèi)部血管較稀疏，可見大片狀無血管壞死區(qū)。以上結(jié)果表明，Micro-CT血管成像可以實現(xiàn)血管三維可視化，直觀顯示肝癌、正常肝臟血管三維形態(tài)特征(圖1，2)。

圖1 MHCC97H肝癌腫瘤Micro-CT成像二維圖 A：肝癌Micro-G圖像橫斷面；B：肝癌Micro-CT圖像冠狀面

圖2 三維重建圖像 A為MHCC97H肝癌原位移植瘤三維重建圖像； B為經(jīng)分割去除肝臟組織后腫瘤的血管三維重建圖像； C為正常肝臟血管三維重建圖像

二、血管定量參數(shù)

與健康肝臟血管相比，肝癌的血管占比、血管分支密度明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義；與健康肝臟血管相比，肝癌血管的平均半徑縮小、平均SOAM增加，差異有統(tǒng)計學意義，表明肝癌內(nèi)部多為細小、扭曲的血管；肝癌血管的平均血管分支長度略小于健康肝臟，差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。見表1。

討 論

本研究基于Micro-CT成像揭示了肝癌裸鼠原位移植瘤血管的三維結(jié)構(gòu)形態(tài)，并從密度和形態(tài)兩方面描述了血管特征。肝癌血管結(jié)構(gòu)在大體形態(tài)和定量特征參數(shù)上均表現(xiàn)出與正常肝臟的明顯異質(zhì)性。正常肝臟血管分布均勻、走行自然，而肝癌血管結(jié)構(gòu)混亂。腫瘤的血管生成進展十分復雜：在早期，血管密實而豐富，隨著腫瘤體積增加，其內(nèi)部出現(xiàn)缺血性壞死，在圖像中表現(xiàn)為沒有造影劑的灌注，這導致血管體積比例相對較低。文獻報道，與生長緩慢的腫瘤相比，生長迅速的腫瘤血管更細小，血管分支的總數(shù)更低[7]，與本研究中肝癌血管分支密度的降低一致。研究表明，由于腫瘤血管直徑小于健康組織，血管直徑可用于區(qū)分健康組織和腫瘤組織[8]。三維圖像顯示肝癌血管較正常肝臟血管扭曲，用平均DF、平均SOAM兩個形態(tài)學參數(shù)來定量血管的曲折度，將抽象的圖像信息轉(zhuǎn)化為具體的特征數(shù)據(jù)。腫瘤組織的曲折度更大，可用于識別良性和惡性腫瘤[6]，本研究結(jié)果也通過平均DF和SOAM得出一致的結(jié)論。

Micro-CT是一種非破壞性的3D成像技術(shù)，以超高的空間分辨率可視化血管的三維結(jié)構(gòu)形態(tài)，具有易于準備，成本低及血管形態(tài)表征等優(yōu)勢，在大鼠肺血管的Micro-CT所顯示的血管直徑最高分辨率為12.5 μm，臨床常用的血管成像技術(shù)如CTA、MRA等均不能顯示類似直徑的血管[9-11]。血管定量分析是以量化的數(shù)據(jù)來描述抽象的血管病變程度。Micro-CT聯(lián)合血管鑄型重建組織血管結(jié)構(gòu)，結(jié)合血管定量分析方法量化血管特征是近幾年的研究熱點，廣泛應(yīng)用于肺血管、腎臟疾病、肝血管及肝纖維化等各個組織及系統(tǒng)[12]。Debbaut等[13]對利用血管腐蝕鑄型方法和Micro-CT對人肝臟血管進行形態(tài)學分析，可顯示肝血管樹的13級分支，肝血管的半徑從13.8 mm到80 μm不等，血管長度從74.4 mm到0.74 mm不等。

此外，采用人肝癌細胞系建立的裸鼠肝原位移植瘤模型可以很好地模擬人肝癌的解剖學特征。在定量分析中選擇整個腫瘤區(qū)域作為ROI，避免了因區(qū)域選擇不充分而導致的錯誤，相比免疫組織化學方法獲得了更準確的結(jié)果。

表1 小鼠正常肝臟和肝癌的血管定量參數(shù)對比結(jié)果(±s)

本研究也有一些局限性。首先，手動劃定腫瘤邊界的瘤體提取方法有待進一步優(yōu)化；其次，腫瘤中的一些血管可能未連接到中心血管樹，從而導致灌注過程中的填充不足；最后，實驗的樣本量較小。

基于Micro-CT成像，該研究展示了肝癌原位移植瘤血管的三維結(jié)構(gòu)，通過量化肝癌和健康肝臟的血管特征差異，可以進一步明確抑制腫瘤血液供應(yīng)的潛在途徑。