苦參素對缺氧/復(fù)氧損傷乳鼠心肌細(xì)胞線粒體保護作用的研究

楊 超

線粒體是細(xì)胞有氧呼吸和能量轉(zhuǎn)化的主要場所，主要由雙層生物膜和嵴構(gòu)成。缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)茏?，致使活性?reactive oxygen species，ROS)大量產(chǎn)生與過剩而引發(fā)氧化應(yīng)激損傷，是各類缺血性心血管疾病共同的病理通路[1,2]。因此，保護線粒體對改善缺血性心血管疾病具有重要意義。苦參素(oxymatrine，OMT)又名氧化苦參堿，是中藥苦參的主要活性成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于喹諾西啶類生物堿，具有良好的抗氧化活性[3]。目前臨床上主要用于慢性乙型病毒性肝炎及腫瘤放化療引起的白細(xì)胞減少癥的治療，近年來研究發(fā)現(xiàn)OMT對缺血性腦損傷后神經(jīng)元線粒體具有保護作用[4]。本研究將通過建立體外H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞模型，探究OMT對H/R所致乳鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷的保護作用及其可能的機制。

材料與方法

1.實驗動物：SPF級SD大鼠乳鼠(<24h)，購自河北省實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(冀)2018-004。

2.藥物與試劑：OMT(純度≥98%)購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(批號：20190331)；DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自美國Gibco公司；胎牛血清、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自美國Invitrogen 公司；二甲基亞砜(DMSO)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；NADH脫氫酶(ND)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、細(xì)胞色素氧化酶(CCO)、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和ATP檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；膜電位(△ψm)、膜通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放度檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司。

3.乳鼠心肌細(xì)胞分離與體外培養(yǎng)：參照李雪麗等[5]報道的方法，無菌操作臺取乳鼠心臟心室組織，剪碎后加濃度0.625g/L胰酶和濃度0.05g/L的Ⅱ型膠原酶后恒溫37℃消化，細(xì)胞懸液過200目篩，1500r/min離心10min取沉淀，以DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)重懸后，經(jīng)37℃、5%CO2壁立1h，收集未貼壁細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為6×105個/毫升，接種于35mm培養(yǎng)皿，置于37℃、5%CO2、100%濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中72h后，細(xì)胞呈同步搏動，用于實驗。

4.乳鼠心肌細(xì)胞分組、給藥與H/R損傷細(xì)胞模型制備：取對數(shù)生長期乳鼠心肌細(xì)胞，消化、重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度為6×105個/毫升，設(shè)正常組、H/R組和OMT低、中、高劑量(20、40、80μg/ml)組，每組設(shè)10皿；造模前30min給藥干預(yù)[6]。除正常組外，其余各組棄培養(yǎng)液并用無糖DMEM沖洗3遍，2毫升/皿加入無糖DMEM培養(yǎng)基(預(yù)充95%N2和5%CO2混合氣15min)，置缺氧盒(通入95%N2和5%CO2混合氣，流速1L/min)，15min后將缺氧盒置細(xì)胞培養(yǎng)箱2.5h為缺氧過程，然后取出培養(yǎng)皿棄上清液，2毫升/皿加入含糖DMEM培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2、100%濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即復(fù)氧。復(fù)氧2h后行各指標(biāo)檢測。

5.線粒體提?。簭?fù)氧2h后，取各組細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后，4℃、650×g離心力離心5min收集細(xì)胞，加入4℃預(yù)冷裂解液于冰上裂解30min后，4℃、650×g離心力離心20min取上清液，然后4℃、7700×g離心20min取沉淀，即為線粒體，通過Lowry法檢測蛋白濃度。

6.線粒體生化指標(biāo)檢測含量檢測：取1mg蛋白量線粒體，參照試劑盒操作說明進行處理后，采用比色法，通過紫外-可見分光光度計檢測線粒體ND、SDH、CCO活性和ATP含量。參照試劑盒操作說明進行處理后，通過紫外-可見分光光度計檢測線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力；通過原子化學(xué)發(fā)光法檢測游離Ca2+濃度。參照試劑盒操作說明進行處理后，遵照△ψm和MPTP開放度檢測試劑盒說明，通過熒光酶標(biāo)儀檢測△ψm水平(激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長590nm)和MPTP開放度(激發(fā)波長540nm，發(fā)射波長580nm)。

7.線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察：復(fù)氧2h后，取各組細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化、無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌3次后離心取細(xì)胞，置2.5%戊二醛固定2h、1%四氧化鋨固定15min后梯度乙醇脫水、丙酮沖洗、環(huán)氧樹脂包埋后行60nm超薄切片，醋酸鈉染色、檸檬酸鉛染色并晾干后，通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)。

8.線粒體MDA含量和SOD、CAT活力檢測：經(jīng)4℃、超聲波破碎線粒體后，遵照試劑盒操作說明，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，黃嘌呤氧化法、鉬酸銨法分別檢測SOD、CAT活力。

結(jié) 果

1.OMT對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞線粒體呼吸酶活性和ATP含量的影響：與正常對照組比較，H/R組乳鼠心肌細(xì)胞線粒體ND、SDH、CCO活性和ATP含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與H/R組比較，OMT中、高劑量組ND、SDH、CCO活性和ATP含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 OMT對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞線粒體呼吸酶活性和ATP含量的影響

2.OMT對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力和Ca2+濃度的影響：與正常對照組比較，H/R組乳鼠心肌細(xì)胞線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力顯著降低，游離Ca2+濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與H/R組比較，OMT中、高劑量組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力顯著升高且游離Ca2+濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 OMT對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力和游離Ca2+濃度的影響

3.OMT對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞線粒體△ψm和MPTP開放度的影響：與正常對照組比較，H/R組乳鼠心肌細(xì)胞線粒體△ψm顯著降低、MPTP開放度顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與H/R組比較，OMT中、高劑量組△ψm顯著升高且MPTP開放度顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見表3。

表3 OMT對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞線粒體△ψm和MPTP開放度的影響

4.OMT對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響：TEM下可見，正常對照組乳鼠心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)和線粒體膜、線粒體嵴等均未見異常；H/R組可見線粒體數(shù)量減少、膜腫脹破裂、膜磷脂層破壞、線粒體嵴溶解斷裂等超微結(jié)構(gòu)病變；與H/R組比較，OMT處理組線粒體膜、嵴超微結(jié)構(gòu)病變明顯改善，其中OMT高劑量組線粒體膜、嵴結(jié)構(gòu)較為完整，優(yōu)于其他組，詳見圖1。

圖1 OMT對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響(TEM，×10000)A.正常對照組；B.H/R組；C.OMT低劑量組；D.OMT中劑量組；E.OMT高劑量組

5.OMT對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞線粒體MDA含量和SOD、CAT活力的影響：與正常對照組比較，H/R組乳鼠心肌細(xì)胞線粒體MDA含量顯著升高，SOD、CAT活力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與H/R組比較，OMT中、高劑量組MDA含量顯著降低，SOD、CAT活力顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表4。

表4 OMT對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞線粒體MDA含量和SOD、CAT活力的影響

討 論

隨著高血壓、高血脂、高血糖等基礎(chǔ)疾病患病人群的增加，心肌梗死發(fā)生率呈逐年上升趨勢，及時疏通血管、恢復(fù)血氧供應(yīng)是臨床搶救心肌梗死患者的關(guān)鍵，但恢復(fù)氧供后ROS大量釋放導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，是引發(fā)二次損傷并嚴(yán)重影響預(yù)后的重要因素[7]。線粒體是心肌細(xì)胞最重要的細(xì)胞器，缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致其電子傳遞鏈?zhǔn)茏枋荝OS生成的主要原因，并且ROS將攻擊破壞線粒體膜和嵴結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬，從而加重病情[8]。因此保護線粒體對改善缺血性心血管疾病預(yù)后至關(guān)重要。

有氧呼吸是實現(xiàn)能量轉(zhuǎn)換、產(chǎn)生ATP并為機體供給能量的主要途徑，而線粒體是實現(xiàn)該過程的場所。有氧呼吸過程依賴于線粒體內(nèi)呼吸酶(ND、SDH、CCO)的催化作用。生理狀態(tài)下，體內(nèi)ROS生成與代謝清除維持動態(tài)平衡，但缺氧/復(fù)氧將病理性刺激ROS大量釋放致使抗氧化酶(SOD、CAT)被過度消耗，不能及時代謝清除的ROS將攻擊破壞核酸、蛋白質(zhì)等大分子，攻擊生物膜不飽和脂肪酸生成具有生物毒性的MDA[9，10]。正常的線粒體△ψm水平對維持線粒體功能至關(guān)重要，Alizadeh等[11]研究發(fā)現(xiàn)△ψm降低將直接影響ATP合成。MPTP開放度病理性升高將破壞離子平衡，導(dǎo)致ROS生成、△ψm下降、細(xì)胞色素C釋放，加重線粒體損傷[12]。

本研究通過分離并體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，制備H/R損傷心肌細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)模型細(xì)胞線粒體呈現(xiàn)數(shù)量減少、膜腫脹破裂、膜磷脂層破壞、線粒體嵴溶解斷裂等超微結(jié)構(gòu)病變，該結(jié)果與陳克芳等[13]研究報道一致；造模前30min給予OMT進行干預(yù)，能夠明顯提高線粒體ND、SDH、CCO活性和ATP含量，降低MDA含量并提高SOD、CAT活力，明顯改善線粒體超微結(jié)構(gòu)病變，提高線粒體△ψm并降低MPTP開放度，提示OMT對H/R所致乳鼠心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷具有保護作用，可能與抑制氧化應(yīng)激和維持線粒體膜穩(wěn)定性有關(guān)。

線粒體具有儲存Ca2+并維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+動態(tài)平衡的作用，線粒體的吸收和釋放依賴Na+-Ca2+交換和Ca2+-ATP酶。ATP酶活力具有ATP依賴性，當(dāng)線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損導(dǎo)致ATP合成受阻時將直接導(dǎo)致ATP酶活力降低。Ca2+-ATP酶活力降低將導(dǎo)致Ca2+泵出功能障礙，而Na+-K+-ATP酶活力降低將引發(fā)Na+-Ca2+交換使Ca2+大量進入線粒體，從而引發(fā)線粒體Ca2+超載[14]。過量的Ca2+能夠破壞線粒體氧化磷酸化過程使ATP合成受阻，進一步抑制ATP酶活性，從而形成“ATP合成受阻-Ca2+超載”的惡性循環(huán)，加重心肌組織損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，造模前30min給予OMT進行干預(yù)，能夠明顯提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力并降低游離Ca2+濃度，提示抑制Ca2+超載可能是OMT保護H/R所致乳鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷的重要機制之一。

綜上所述，OMT對H/R所致乳鼠心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷具有一定的保護作用，作用機制可能與抑制線粒體Ca2+超載、抑制氧化應(yīng)激和維持膜穩(wěn)定性有關(guān)。