20-03軟棗獼猴桃雄株組織培養(yǎng)技術(shù)研究

楊殿靜 曲淼 劉政 王丹萍 張功 何廣仁

軟棗獼猴桃（Actinidia ?arguta（Sieb.et ?Zucc.）Planch.ex ?Miq.），屬獼猴桃科（Actinidiaceae），獼猴桃屬（Actinidia），落葉大藤本，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值。主要采用種子及扦插方式進(jìn)行種苗繁殖。但種子繁殖周期長、苗木生長勢參差不齊;枝條扦插受母株數(shù)量及質(zhì)量限制，繁殖系數(shù)較低，減慢了優(yōu)異資源的馴化及推廣工作。植物組織培養(yǎng)具有生長周期短、繁殖系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用此技術(shù)可加快軟棗獼猴桃優(yōu)異資源的馴化及種苗繁殖速度。本文是以延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院樸一龍教授提供的20-03軟棗獼猴桃雄性株進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得的試驗(yàn)結(jié)果技術(shù)總結(jié)。

1 誘導(dǎo)培養(yǎng)

1.1 組織培養(yǎng)準(zhǔn)備

1.1.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基準(zhǔn)備：①M(fèi)S+ZT2mg/l+NAA0.2mg/l+GA31.0mg/l;②MS+ZT1.0mg/l+NAA0.1mg/l+GA31.0mg/l;③MS+ZT2mg/l+NAA0.2mg/l;④MS+ZT1.0mg/l+NAA0.1mg/l;⑤MS+6BA2mg/l+NAA0.2mg/l+GA31.0mg/l;⑥MS+6BA1.0mg/l+NAA0.1mg/l+GA31.0mg/l。

每個配方加白糖30g/l、，瓊脂4.1g/l，ph6.0培養(yǎng)基準(zhǔn)備50瓶，240ml培養(yǎng)瓶裝60ml培養(yǎng)基，0.103MPa，121℃，20min濕熱滅菌。

1.1.2 工具準(zhǔn)備：手術(shù)刀、剪子、鑷子、接種盤包好，170℃，120min干熱滅菌。

1.1.3 滅菌液準(zhǔn)備：①75%酒精2000ml放入2000ml的容量瓶中。②01%HgCl2000ml放入2000ml容量瓶中，瓶中加入1滴吐溫-20。③無菌水準(zhǔn)備：每次10瓶1000ml三角瓶裝入600ml自來水封口，0.103MPa，121℃，30min濕熱滅菌。④500ml廣口瓶做滅菌瓶，封口，170℃，120min干熱滅菌。

1.1.4 接種準(zhǔn)備：接種室放入接種工具，培養(yǎng)基，無菌水，O3消毒12h，石棚紫外線30min照射表面滅菌。

1.1.5 材料準(zhǔn)備：延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院樸一龍教授提供的20-03軟棗獼猴桃雄性株盆栽苗，選擇生長健壯，無病蟲害的當(dāng)年生半木質(zhì)化帶腋芽枝條。

1.2 滅菌接種

1.2.1 滅菌：①半木質(zhì)化帶腋芽雄花軟棗獼猴桃枝條用剪刀去除葉片，葉柄長度留1cm，莖段長度5～10cm，能放入滅菌瓶中即可，上芽和下芽莖段長度最低1cm。②將切好莖段放入5%洗滌液中用軟毛刷清洗莖段表面，尤其葉腋處，反復(fù)清洗幾次，再用自來水沖洗2～4h。③將清洗好的莖段在超凈工作臺上取出放入滅菌瓶中，在超凈工作臺上倒入75%酒精至瓶一半，搖晃30s，殘液倒出;加入0.1%HgCl瓶2/3，搖晃2min，殘液倒出;再用無菌水清洗6次，徹底l殘液。滅菌完成。

1.2.2 接種：①接種材料處理：取出滅菌的半木質(zhì)化帶腋芽雄花軟棗獼猴桃枝條，放入接種盤中，去除葉柄，在滅菌莖段兩端0.5cm處切去，再將長莖段切分成1～1.5cm莖段，每莖段帶1各腋芽。②切分成1～1.5cm莖段用鑷子插入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每1瓶插入1個莖段，直插入或斜插入，芽朝上，芽露出在培養(yǎng)基面上。③接種完的培養(yǎng)瓶記錄各類事項，放入培養(yǎng)室。

1.2.3 培養(yǎng)條件：培養(yǎng)室溫度25℃，空氣相對濕度50%，光照強(qiáng)度2000Lux，光照時間為晝12h，夜12h。

1.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)

1.3.1 初代接種污染率、材料殺死率：接種污染率受采條部位、時間、地點(diǎn)、存放時間、清洗程度、滅菌時間、各項準(zhǔn)備工作質(zhì)量、人員操作水平多因素影響。滅菌時間長初代接種材料污染率低、材料被滅菌液殺死率高;嫩莖段相對初代接種材料污染率低、材料被滅菌液殺死率高。0.1%HgCl滅菌2min，初代接種污染率平均65%、材料殺死率平均16%。剪切材料處理時間長，初代接種污染率更高。

1.3.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選結(jié)果與討論：

①20—03雄株初代誘導(dǎo)30d統(tǒng)計結(jié)果

②20-03雄株初代誘導(dǎo)30d統(tǒng)計結(jié)果討論：Ga3具有打破軟棗獼猴桃夏芽休眠，促進(jìn)芽萌發(fā);Zt促進(jìn)芽萌發(fā)效果好于6BA，更適于軟棗獼猴桃組織培養(yǎng);在可見芽情況下，嫩芽更易萌發(fā)。

2 繼代增殖

2.1 繼代時間：誘導(dǎo)培養(yǎng)60～70d，芽伸長5cm以上，形成長莖段后，可以切剪成0.5～1cm帶芽莖段，轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基上。

2.2 繼代培養(yǎng)基：①M(fèi)s+Zt1.0mg/l+NAA0.1mg/l+GA31.0mg/l;

②Ms+Zt2.0mg/l+NAA0.2mg/l+GA31.0mg/l;③Ms+Zt3.0mg/l+NAA0.1mg/l+GA31.0mg/l;④Ms+Zt2.0mg/l+NAA0.4mg/l+GA31.0mg/l;⑤Ms+Zt2.0mg/l+NAA0.1mg/l+GA31.0mg/l;⑥Ms+Zt1.0mg/l+NAA0.05mg/l+GA31.0mg/l。

2.3 20-03雄株繼代培養(yǎng)60d統(tǒng)計結(jié)果

2.4 20-03雄株繼代培養(yǎng)60d統(tǒng)計結(jié)果討論：①Zt：NAA10：1，Zt1.0mg/l-2.0mg/l，NAA0.1mg/l-0.2mg/l比例，濃度適于軟棗獼猴桃繼代培養(yǎng)，芽綠色、莖間適中、莖粗度適中，適合轉(zhuǎn)接繼代操作。①②培養(yǎng)基為適宜繼代培養(yǎng)。②繼代時間以55～65d為宜，苗高5～7cm，莖段硬度宜于剪切。培養(yǎng)基營養(yǎng)、水分已不適合繼續(xù)培養(yǎng)。

2..5 激素替代試驗(yàn)：因?yàn)閆t價格高，是6BA、Kt的百倍、幾十倍，為節(jié)約生產(chǎn)成本，用6BA、Kt替代Zt，試驗(yàn)結(jié)果顯示，6BA在繼代5代以后可以替代Zt，但增殖系數(shù)有所下降;Kt在培養(yǎng)軟棗獼猴桃中沒有增殖作用。

2.6 繼代接種密度：軟棗獼猴桃繼代接種密度與培養(yǎng)基營養(yǎng)消耗、個體光照強(qiáng)度、呼吸消耗等密切相關(guān)，關(guān)系繼代苗異養(yǎng)能力和生長勢，密度大，苗弱小，密度小，增殖率低，綜合各方因素和觀察，瓶直徑6.5cm，240ml培養(yǎng)瓶繼代每瓶接種7～8株，同時方便操作。

2.7繼代培養(yǎng)條件：基本與誘導(dǎo)培養(yǎng)條件相同，但有時為了延緩繼代轉(zhuǎn)接時間壓力，可以降低培養(yǎng)溫度至20～22℃，延緩軟棗獼猴桃生長速度，保證繼代轉(zhuǎn)接時，苗處于最佳時期。

3 生根培養(yǎng)

3.1 生根培養(yǎng)基篩選：①1/2Ms+NAA0.5mg/l;②1/2Ms+NAA0.3mg/l;③1/2Ms+NAA0.1mg/l;④1/4MS+NAA0.5mg/l;⑤1/4MS+NAA0.3mg/l;⑥1/4MS+NAA0.1mg/l。

每個配方加白糖15g/l，瓊脂4.1g/l，ph6.0培養(yǎng)基準(zhǔn)備50瓶，240ml培養(yǎng)瓶裝60ml培養(yǎng)基，0.103MPa，121℃，20min濕熱滅菌。

3.2 20-03雄株生根培養(yǎng)統(tǒng)計結(jié)果

3.3 20-03雄株生根培養(yǎng)統(tǒng)計結(jié)果討論：①莖基是否有愈傷與苗移栽成活率密切相關(guān)，愈傷組織越大，苗移栽成活率越低。莖基直接生根，苗移栽成活率顯著提高。②培養(yǎng)基營養(yǎng)水平太低，不利于生根。③適宜生根培養(yǎng)基為生根培養(yǎng)基。④生根40d后即可移栽。

3.4 溫室移栽煉苗成活率與生根培養(yǎng)關(guān)系

3.4.1 試管苗生根階段的煉苗

直徑6.5cm、容量240ml培養(yǎng)瓶中苗數(shù)量與苗成活率

討論：綜合育苗成本、操作效率、成活率等因素，生根階段每瓶苗數(shù)量適宜5株。

3.4.2 生根培養(yǎng)時間篩選（每瓶培養(yǎng)基60ml）

討論：軟棗獼猴桃試管苗生根培養(yǎng)階段培養(yǎng)時間與培養(yǎng)基成分消耗、培養(yǎng)條件密切相關(guān)。試驗(yàn)顯示，瓶中生根40d軟棗獼猴桃試管苗可以入溫室煉苗，是適應(yīng)時間。