玉米轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)探討

周恪馳 何長(zhǎng)安 紀(jì)春學(xué) 王輝 張恒

摘 要：本文以實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)為例，對(duì)于玉米轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行分析。在具體處理中，會(huì)組建實(shí)驗(yàn)來(lái)完成陽(yáng)性質(zhì)粒、調(diào)控元件、目的基因、標(biāo)記基因等內(nèi)容的檢測(cè)，從而積累有價(jià)值的數(shù)據(jù)信息，為后續(xù)同類型檢測(cè)活動(dòng)的順利開(kāi)展奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：陽(yáng)性質(zhì)粒;轉(zhuǎn)基因成分;熒光PCR檢測(cè)技術(shù)

轉(zhuǎn)基因作物由于抗逆性強(qiáng)或產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn)，在全球范圍內(nèi)得以廣泛種植。近年來(lái)，隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的不斷增加，關(guān)于其在食品和環(huán)境安全等方面存在的爭(zhēng)議也越來(lái)越多，急需通過(guò)加強(qiáng)檢測(cè)來(lái)為監(jiān)管提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。熒光PCR技術(shù)具有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、靈敏度高、精密度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，將其應(yīng)用到玉米轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)當(dāng)中，可以提升檢測(cè)效率和檢測(cè)精準(zhǔn)度，從而為食品安全性的不斷提升奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)組建要點(diǎn)

1.1 材料和儀器

在此次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所使用到的材料為轉(zhuǎn)基因玉米樣品和非轉(zhuǎn)基因玉米樣品。而使用到的如下：①Probe ?q ?PCR ?Super ?Mix，為提升實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，需評(píng)估合作公司，篩選綜合實(shí)力最強(qiáng)的公司進(jìn)行試劑的購(gòu)買(mǎi)。②核酸蛋白質(zhì)分析儀，可選擇Nanodrop 2000c這一型號(hào)，以滿足相應(yīng)的分析需求。③實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀，選用7300plus型號(hào)儀器，使用前做好調(diào)試，確保后續(xù)活動(dòng)的順利推進(jìn)。④高速臺(tái)式離心機(jī)，結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行選擇，以滿足后續(xù)應(yīng)用要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 進(jìn)行DNA提取

在對(duì)DNA進(jìn)行提取時(shí)，多使用溴化十六烷三甲基銨來(lái)作為提取載體，從而獲取到轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米的DNA基因組。對(duì)于提取后的DNA基因組，也需要利用核算蛋白質(zhì)分析儀來(lái)檢測(cè)具體濃度，此過(guò)程中也會(huì)提前將母液稀釋到100ng/μl，隨后將其放置在定量PCR模板中，并且在-20℃環(huán)境中進(jìn)行保存。

1.2.2 陽(yáng)性質(zhì)粒的構(gòu)建

作為陽(yáng)性質(zhì)控的陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)至關(guān)重要，陽(yáng)性質(zhì)控的檢出屬于非常重要的內(nèi)容，這也是順利完成轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的基礎(chǔ)條件。在具體研究中，根據(jù)轉(zhuǎn)基因外源序列的信息構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)粒為核心的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。通過(guò)人工合成的方法來(lái)合成啟動(dòng)子基因、終止子基因、抗蟲(chóng)基因草丁膦抗性基因和篩選基因的堿基序列，隨后也會(huì)將其關(guān)聯(lián)在TOPO載體中，借助轉(zhuǎn)化的方式融入到感受態(tài)細(xì)胞中，等待基因穩(wěn)定之后，也會(huì)依次進(jìn)行PCR檢測(cè)處理、酶切處理、基因測(cè)序，獲取到相應(yīng)的數(shù)據(jù)信息，而搭建的陽(yáng)性質(zhì)粒也會(huì)用作陽(yáng)性質(zhì)控，滿足后續(xù)的應(yīng)用需求。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增

完成上述工作后，會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米樣品中的DNA序列進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增處理，所使用到的試劑如下：①Probe ?q ?PCR Super ?Mix共10μL;②正反向引物各1μL;③反應(yīng)探針1μL;④滅菌雙蒸水共計(jì)7μL。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的反應(yīng)過(guò)程如下，在94℃溫度下進(jìn)行預(yù)變性處理，時(shí)間長(zhǎng)度為10min，隨后在94℃溫度下進(jìn)行變性處理，總時(shí)長(zhǎng)為30s，最后在94℃溫度下進(jìn)行延伸處理，總時(shí)長(zhǎng)為34s，如此循環(huán)處理40次后可以得到目標(biāo)物。在實(shí)驗(yàn)中也會(huì)將陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，而非轉(zhuǎn)基因玉米的DNA則會(huì)作為陰性對(duì)照，而滅菌處理后的超純水和空模板則會(huì)作為空白對(duì)照，由此來(lái)提升統(tǒng)計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.4 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

完成上述工作后，利用實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀來(lái)對(duì)擴(kuò)增后數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)量，然后利用分析軟件來(lái)對(duì)擴(kuò)增數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，主要以擴(kuò)增曲線、表格等方式進(jìn)行展示，從而提高數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的直觀性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 陽(yáng)性質(zhì)粒檢測(cè)

在此次實(shí)驗(yàn)中，會(huì)將陽(yáng)性質(zhì)粒稀釋液作為模板，隨后向其中添加調(diào)控基因引物、目的基因引物和篩選基因引物，隨后利用熒光PCR實(shí)驗(yàn)儀來(lái)采集相應(yīng)數(shù)據(jù)。根據(jù)所統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)信息可以了解到，相較于其他載體，使用陽(yáng)性質(zhì)粒可以更好的和探針與引物進(jìn)行匹配，可以將其作為轉(zhuǎn)基因玉米樣品檢測(cè)時(shí)使用到的陽(yáng)性對(duì)照物，能夠基于此獲取到更加有效的分析數(shù)據(jù)。并且和轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性樣品的DNA進(jìn)行對(duì)比，所使用到的陽(yáng)性質(zhì)粒會(huì)作為質(zhì)控參考，而且利用其對(duì)外輸出時(shí)得到的數(shù)據(jù)也更加穩(wěn)定，這樣也更加有利于標(biāo)準(zhǔn)化陽(yáng)性質(zhì)控活動(dòng)的推進(jìn)，得到準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)信息。

2.2 調(diào)控元件檢測(cè)

在具體實(shí)驗(yàn)中，會(huì)將轉(zhuǎn)基因玉米樣品的DNA組，分別利用啟動(dòng)子（包括pCaMV35S引物、pRice-Actin引物和p ?FMV35S引物）、終止子引物（包括tNOS引物、tE9引物和tCaMV35S引物）進(jìn)行處理，待探針完成處理之后，也會(huì)借助熒光PCR儀對(duì)其進(jìn)行定量處理，隨后對(duì)于Ct數(shù)值進(jìn)行求解，常規(guī)情況下會(huì)將Ct≤35.0作為檢出時(shí)的判斷依據(jù)?；谒玫降南嚓P(guān)數(shù)據(jù)可以了解到，利用啟動(dòng)子引物處理的DNA組和終止子引物處理的DNA組中都順利檢出，所得到Ct平均值為29.35±0.13（pCaMV35S基因）、31.23±0.23（pRice-Actin基因）、28.35±0.35（tNOS基因）、30.11±0.21（tCaMV35S基因）、36.75±0.12（p ?FMV35S基因）和40.32±0.25（tE9基因），由數(shù)據(jù)可以看出，轉(zhuǎn)基因玉米樣品中并不包含p ?FMV35S基因和tE9基因，但其他基因都包含在內(nèi)[1]。

2.3 目的基因分析

在目的基因分析過(guò)程中，主要目的是篩選抗蟲(chóng)基因（包括Cry1A（c）基因、Cry3A基因）、抗除草劑基因（包括CP4-EPSPS基因、CTP2-CP4-EPSPS基因）、草丁膦抗性基因（Bar基因），查看其在轉(zhuǎn)基因玉米樣品中的存在情況。具體實(shí)踐中會(huì)借助熒光PCR儀對(duì)其進(jìn)行定量處理，隨后對(duì)于Ct數(shù)值進(jìn)行求解，常規(guī)情況下會(huì)將Ct≤35.0作為檢出時(shí)的判斷依據(jù)。根據(jù)所得到的檢測(cè)數(shù)據(jù)可以了解到，所得到的Ct數(shù)值為27.35±0.13（Cry1A（c）基因）、31.23±0.23（CP4-EPSPS基因）、29.35±0.25（CTP2-CP4-EPSPS基因）、36.11±0.21（Cry1A（c）基因）和41.75±0.12（Bar基因），根據(jù)數(shù)據(jù)可以了解到，在轉(zhuǎn)基因玉米樣品中，Cry1A（c）基因和Bar基因并沒(méi)有檢出，而其它基因都順利檢出，表示樣品中含有這些基因[2]。

2.4 篩選標(biāo)記基因

在標(biāo)記基因分析過(guò)程中，主要目的是篩選PMI基因、NPTII基因，具體實(shí)踐中會(huì)借助熒光PCR儀對(duì)其進(jìn)行定量處理，隨后對(duì)于Ct數(shù)值進(jìn)行求解，常規(guī)情況下會(huì)將Ct≤35.0作為檢出時(shí)的判斷依據(jù)。根據(jù)所得到的檢測(cè)數(shù)據(jù)可以了解到，所得到的Ct數(shù)值為33.36±0.21（PMI基因）、42.35±0.45（NPTII基因），根據(jù)所得數(shù)據(jù)可以了解到，在轉(zhuǎn)基因玉米樣品中包含了PMI基因，但是沒(méi)有NPTII基因[3]。

結(jié)束語(yǔ)：綜上所述，在本文研究中，利用熒光PCR檢測(cè)法來(lái)確定轉(zhuǎn)基因玉米中的基因組成，并且具備了良好的應(yīng)用效果[4]。通過(guò)梳理應(yīng)用時(shí)需要注意的相關(guān)內(nèi)容，不僅可以積累價(jià)值數(shù)據(jù)，而且也為后續(xù)檢測(cè)活動(dòng)的順利開(kāi)展提供了科學(xué)參考。

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