肉桂抑菌活性部位提取工藝優(yōu)化及HPLC定量研究

翁宗昱，李紫晗，孫 琴，王元清

(中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

肉桂(CinnamomumcassiaPreesl)原名菌桂、牡桂，系樟科樟屬，是重要的藥用和食用植物，國(guó)產(chǎn)肉桂為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPreesl)的干燥樹(shù)皮[1]，主要分布于廣西、廣東等地，廣西的產(chǎn)量占全國(guó)的50%。肉桂中主要含有揮發(fā)油、黃酮、黃烷醇、萜類(lèi)、木質(zhì)素、多酚、香豆素、皂苷、多糖等多種類(lèi)型的化合物[2]。揮發(fā)油為肉桂的主要活性部位，其中主要有桂皮醛、桂皮醇、甲氧基桂皮醛、α-蒎烯、α-蓽澄茄油萜等[2-3]，現(xiàn)代藥理研究表明肉桂具有減弱腸胃刺激、強(qiáng)心、改善微循環(huán)、抗炎等多種生理活性[4]?，F(xiàn)代藥理研究亦表明肉桂揮發(fā)油中主要成分為桂皮醛，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、降糖、抗菌、抗腫瘤、抗血小板聚集、抗心肌缺血和抗凝血等多種藥理作用[5-8]?，F(xiàn)有研究有對(duì)肉桂精油提取方法進(jìn)行報(bào)道[9-10]，但是肉桂采用水蒸氣蒸餾法提取時(shí)，通常只對(duì)精油進(jìn)行研究，沒(méi)有對(duì)蒸餾時(shí)的芳香水液進(jìn)行分析。本研究對(duì)肉桂中抗菌活性部位進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)提取工藝優(yōu)化及主要成分定量分析，以期為肉桂在食品藥品中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

202-OA型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；SPX-250-GB型恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；G154DW型立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(致微(廈門(mén))儀器有限公司)；YP1002N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；BIO-KONT型比濁管(康泰生物)；1-Hole Punch打孔機(jī)(上海堅(jiān)明辦公用品有限公司)；TS-111B型搖床(上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Agilent1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)。

1.2 試藥

肉桂(批號(hào)：15120717，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：《中國(guó)藥典》2015版，湖南振興中藥飲片實(shí)業(yè)有限公司)；牛肉膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；蛋白胨(上海禽類(lèi)蛋品公司禽蛋二廠)；NaCl(西隴化工股份有限公司)；無(wú)菌水(自制)；肉桂酸對(duì)照品(南昌貝塔生物科技有限公司)；桂皮醛(南昌貝塔生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 肉桂抑菌活性部位篩選

2.1.1 肉桂提取 將100 g肉桂利用水蒸氣蒸餾法提取出肉桂揮發(fā)油并收集蒸餾后的芳香水液，將收集好的芳香水液濃縮后定容至100 mL，制得濃度為1 g/mL的濾液，冷藏備用。

2.1.2 抑菌活性篩選 采用濾紙片法測(cè)定抑菌活性。移取7 μL的肉桂精油或肉桂濾液分別滴加至兩片直徑為6 mm 的滅菌濾紙片上，使其充分吸附。另外移取7 μL生理鹽水滴加至另一片直徑6 mm的濾紙片上，作為陰性對(duì)照。將上述3片濾紙片均勻放置于含有金黃色葡萄球菌試驗(yàn)菌種的平板上，置恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)中培養(yǎng)24 h后，觀察有無(wú)抑菌圈篩選肉桂抑菌活性部位。

2.2 提取工藝

利用水蒸氣蒸餾法提取出肉桂精油，分別對(duì)浸泡時(shí)間、加水量以及蒸餾時(shí)間進(jìn)行考察，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)，獲取肉桂精油的最佳提取工藝參數(shù)。

2.3 精油中主要成分含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液配制 精密稱(chēng)取肉桂酸與桂皮醛對(duì)照品適量，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，獲得含21 μg/mL的肉桂酸與222 μg/mL的桂皮醛混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 肉桂精油樣品制備 各取100 μL肉桂精油加900 μL甲醇于EP管中，混勻，再取50 μL加1 950 μL甲醇置于5 mL EP管中，混勻，過(guò)濾，即得肉桂精油的液相色譜樣品。

2.3.3 色譜條件 安捷倫色譜柱C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速0.9 mL/min，λ=254 nm，進(jìn)樣量：10 μL，乙腈：0.1%磷酸水為流動(dòng)相，時(shí)間(min)：0-15-27-35-38-40，乙腈(%)：28-28-35-85-85-28。

2.3.4 樣品含量測(cè)定 取樣品與混合對(duì)照品在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算精油中肉桂酸與桂皮醛的含量。

3 結(jié)果

3.1 抑菌活性部位篩選

采用濾紙片研究肉桂精油和肉桂水液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性圖，抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。由圖1可知，肉桂經(jīng)水蒸氣蒸餾法獲得的肉桂精油有明顯的抑菌圈，而蒸餾時(shí)的芳香水提液沒(méi)有抑菌圈，表明肉桂精油對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用，而芳香水液無(wú)抑菌作用，從而篩選出肉桂抑菌活性部位為精油。

圖1 肉桂精油(A)、肉桂芳香水液(B)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果

3.2 單因素考察結(jié)果

選擇影響精油提取率的幾個(gè)主要因素：浸泡時(shí)間、加水量、提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，為均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

浸泡時(shí)間的影響：每份100 g剪碎的肉桂均加水600 mL，不同的浸泡時(shí)間(0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h)，提取時(shí)間均為6 h，考察不同浸泡時(shí)間的精油提取量。由圖2可知，浸泡時(shí)間為0.5 h時(shí)，肉桂精油的提取量最高；隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，肉桂精油提取量變化不明顯?？赡茉?.5 h內(nèi)，溶液已經(jīng)充分滲透進(jìn)肉桂粗粉組織中，使組織中達(dá)到飽和。

加水量的影響：每份100 g剪碎的肉桂均浸泡0.5 h，提取時(shí)間為6 h，考察加水量為600 mL、700 mL、800 mL、900 mL、1 000 mL時(shí)的精油提取量。由圖2可知，加水量為700 mL時(shí)，揮發(fā)油提取量最多，隨著加水量的增加，肉桂精油提取量變化不大；加水量較少時(shí)，提取量較低。加水量少時(shí)，產(chǎn)生的水蒸汽較少，從而隨水蒸汽蒸餾出來(lái)的油量也少；但加水量太多時(shí)，可能是因?yàn)榉枷闼芤褐械挠洼^多，從而使收集到的精油量減弱。

提取時(shí)間的影響：每份100 g剪碎的肉桂均浸泡0.5 h，加水700 mL，考察蒸餾時(shí)間為4 h、5 h、6 h、7 h、8 h的精油提取量。由圖2可知，提取時(shí)間在4～7 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加而提取量增加，7 h時(shí)提取量較高；隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，略有減少，可能時(shí)間太長(zhǎng)導(dǎo)致精油揮發(fā)損失而減少。

圖2 各因素對(duì)肉桂精油提取量的影響

3.3 均勻設(shè)計(jì)

3.3.1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)之后，設(shè)計(jì)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化工藝。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)水平。本實(shí)驗(yàn)均勻設(shè)計(jì)采用3因素5水平：浸泡時(shí)間分別為0 min、20 min、40 min、60 min、80 min；蒸餾時(shí)間分別為4 h、5 h、6 h、7 h、8 h；加水量分別為6倍量(600 mL)、7倍量(700 mL)、8倍量(800 mL)、9倍量(900 mL)、10倍量(1 000 mL)。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。按均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，分別收集精油，量取體積，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 U5*(53)均勻設(shè)計(jì)因素水平

表2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

表4 回歸模型系數(shù)及檢驗(yàn)結(jié)果

3.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取剪碎的肉桂3份各100 g，均按優(yōu)選出來(lái)的肉桂精油最佳水蒸汽蒸餾提取工藝提取3次，即浸泡20 min，加水量600 mL，提取時(shí)間8 h進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，收集精油量，結(jié)果見(jiàn)表5。3次驗(yàn)證試驗(yàn)的平均值為1.72 mL，與預(yù)測(cè)結(jié)果接近。所以經(jīng)均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選，肉桂抑菌活性部位精油的水蒸氣蒸餾提取工藝為100 g粗粉浸泡20 min，加水量為 600 mL(6倍量)，提取時(shí)間為8 h。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3.4 肉桂精油HPLC分析結(jié)果

3.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察結(jié)果 采用“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，對(duì)照品及樣品的色譜見(jiàn)圖3，可見(jiàn)在上述色譜條件下，樣品和對(duì)照品的色譜分離度較好，無(wú)干擾。

3.4.2 肉桂精油的定量分析結(jié)果 采用“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，樣品中的各成分含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，肉桂精油中桂皮醛含量高達(dá)629.38 mg/g，超過(guò)50%；肉桂酸含量為18.76 mg/g。

表6 肉桂精油中肉桂酸與桂皮醛含量結(jié)果

4 討論

抑菌活性篩選研究中，雖有文獻(xiàn)[10]報(bào)道肉桂精油的抑菌活性，但沒(méi)有研究比較肉桂水蒸氣蒸餾時(shí)精油與芳香水液的活性。該研究通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)對(duì)肉桂水蒸氣蒸餾的提取部位進(jìn)行抑菌活性篩選，研究發(fā)現(xiàn)，主要是精油部位具有抑菌活性，可能與肉桂的主要活性成分桂皮醛有關(guān)。文獻(xiàn)[2]報(bào)道，桂皮醛具有揮發(fā)性，也是肉桂精油中的主要活性成分。在水蒸氣蒸餾過(guò)程中，主要活性成分集中于精油中，從而芳香水液沒(méi)有體現(xiàn)出抑菌活性。

在提取工藝研究中，經(jīng)單因素試驗(yàn)后再采用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)肉桂抑菌活性部位精油進(jìn)行蒸餾優(yōu)選，獲得其最佳蒸餾提取工藝條件為100 g，肉桂浸泡20 min，加水量為 6倍量(600 mL)，提取時(shí)間為8 h。優(yōu)選出來(lái)的工藝經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證可行，可為肉桂精油的蒸餾提取與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1-肉桂酸；2-桂皮醛

肉桂精油主要成分分析中，桂皮醛含量高達(dá)629.38 mg/g，在精油中超過(guò)了50%，充分說(shuō)明桂皮醛是肉桂精油的主要成分；本研究中的桂皮醛含量與文獻(xiàn)[10]有一定差異，可能與肉桂的產(chǎn)地、采收、加工及生產(chǎn)時(shí)間有一定關(guān)系。