乙醛脫氫酶基因過表達釀酒酵母在黃酒中降高級醇作用

江 森，王 歡，何亞輝，陳葉福，鄧慶博，郭學(xué)武，肖冬光

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

黃酒主要是以大米為原料，加入麥曲、酵母等糖化發(fā)酵劑釀制而成的發(fā)酵酒，是我國民族文化特產(chǎn)之一。因含有豐富的氨基酸、小分子多肽、維生素、有機酸和微量元素等，享有“液體蛋糕”的美譽[1-2]。近年來，隨著物質(zhì)水平的不斷提高，消費者偏向于風(fēng)味、健康雙導(dǎo)向產(chǎn)品[3]。但黃酒較其他酒而言高級醇含量較高，消費者普遍反映有易上頭、易醉等現(xiàn)象[4]，所以降低黃酒中高級醇含量對于提高黃酒品質(zhì)具有重要意義。

高級醇是指含三個以上碳原子的一元醇類，又稱雜醇油。黃酒中的高級醇主要有正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇等[5]。適量的高級醇對酒體呈香呈味有積極作用，但是含量過高會產(chǎn)生異雜味和較強的致醉性，俗稱“上頭”[6]。黃酒中的高級醇主要由釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）從兩條代謝途徑產(chǎn)生，一是氨基酸分解代謝途徑，即Ehrlich途徑[7]，黃酒釀造原料富含氨基酸，氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶的催化下通過轉(zhuǎn)氨作用形成α-酮酸，然后經(jīng)過脫羧和脫氫產(chǎn)生相應(yīng)的高級醇。二是合成代謝途徑，即葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑、三羧酸（tricarboxylic acid cycle，TCA）循環(huán)也可生成α-酮酸，α-酮酸除了合成氨基酸，也可經(jīng)脫羧和脫氫生成高級醇[8]。

乙醛脫氫酶家族是釀酒酵母丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase bypass，PDH）旁路中的酶系，可以氧化乙醛產(chǎn)生乙酸[9]，包括五個同工酶，分別由基因ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6編碼[10]。本課題組之前的研究表明，過表達乙醛脫氫酶基因ALD6可以降低高級醇含量[11]。但其他乙醛脫氫酶家族基因?qū)︶劸平湍府a(chǎn)高級醇的影響尚無明確報道。

傳統(tǒng)的黃酒工藝通常是以大米為原料，麥曲作為糖化劑。在我國北方也常使用黍米和麥曲作為黃酒發(fā)酵的原輔料，而在南方以大米作為原料、純種根酶曲作糖化發(fā)酵劑也非常普遍[9]。此外，郭健等[12]研究表明，在小曲酒中純種根酶曲培菌糖化時間對小曲酒的品質(zhì)影響較大且酵母在純種根酶曲培菌糖化24 h后接入的工藝較優(yōu)。因此，本研究構(gòu)建ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6基因過表達釀酒酵母菌株，研究其在麥曲黃酒發(fā)酵工藝和根霉曲黃酒發(fā)酵工藝下的發(fā)酵性能及其對高級醇生成的影響，為降低黃酒中高級醇產(chǎn)量提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用到的菌株與質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in the study

1.1.2 培養(yǎng)基[11]

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L。

LB培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L。

半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：半乳糖10 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L。

一級種子培養(yǎng)基：糖度為8°Bx的玉米水解液，酵母浸粉5 g/L。

二級種子培養(yǎng)基：糖度為12°Bx的玉米水解液，酵母浸粉5 g/L。

以上培養(yǎng)基蒸餾水配制，自然pH值，固體培養(yǎng)基需加瓊脂20 g/L，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

麥曲、黍米：山東蘭陵美酒股份有限公司；大米（淀粉含量約78%）：市售；純種根霉曲（Q303）：貴州立高輕工科技發(fā)展有限公司；α-淀粉酶（29萬U/mL）、糖化酶（10萬U/mL）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；rTaq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5U/μL）、LATaqDNA聚合酶（5 U/μL）：中國大連寶生物有限公司；遺傳霉素（G418）：美國Merck公司；DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、切膠回收試劑盒：美國Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCT-200聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴增儀、PowerPacTM型電泳儀：美國BIO-RAD公司；Reference-2型移液槍：法國吉爾森公司；H1650-W型高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；7890C型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、1100型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乙醛脫氫酶基因過表達菌株的構(gòu)建

引物設(shè)計：根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫中的Saccharomyces cerevisiae基因序列使用Primer 5.0軟件設(shè)計PCR引物，用于改造菌株的構(gòu)建及驗證。本實驗所用引物序列見表2。實驗所用引物由金唯智（廣州）生物科技有限公司合成。

目的基因的獲得：參考NCBI GenBnak數(shù)據(jù)庫中釀酒酵母模式菌株S288C（Taxonomy ID：559292）的乙醛脫氫酶基因序列合成目的基因，且合成過程不涉及密碼子優(yōu)化及修飾等，至此得到與NCBI GenBnak數(shù)據(jù)庫中序列保持一致的目的基因。目的基因片段由金維智（廣州）生物科技有限公司合成。

乙醛脫氫酶基因過表達菌株的構(gòu)建：本研究所有菌株的構(gòu)建選擇釀酒酵母GAL80基因位點作為整合過表達位點，使用強啟動子PPGK1與終止子TPGK1過表達乙醛脫氫酶基因（以過表達ALD2基因為例）。以本實驗室釀酒酵母改造菌株α-PAP基因組作為模板，用引物對FA-U/ALD2-FA-D和ALD2-FB-U/FB-D分別通過PCR擴增得到基因片段ALD2-FA與ALD2-FB，基因片段ALD2-FA包括GAL80位點上同源臂和啟動子PPGK1序列，基因片段ALD2-FB包括終止子TPGK1、KanMX表達盒與GAL80位點下同源臂序列，過表達ALD2基因同源重組過程見圖1。以帶有合成ALD2基因的質(zhì)粒pUC57-ALD2的基因組為模板，采用引物對ALD2-U/ALD2-D PCR擴增得到ALD2基因片段。用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[13]將PCR擴增得到的三個基因片段導(dǎo)入單倍體酵母菌株AY12α中，通過同源重組得到改造菌株。轉(zhuǎn)化后的細胞涂布于含有300 μg/mL的G418的YEPD平板上進行篩選，PCR定點驗證。

表2 本研究所用PCR引物Table 2 PCR primers used in the study

圖1 過表達ALD2基因同源重組過程Fig.1 Homologous recombination process of ALD2 gene overexpression

轉(zhuǎn)化子篩選標(biāo)記的去除[14]：用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將PGAPza質(zhì)粒導(dǎo)入改造菌株中，通過Cre-Lxop系統(tǒng)將整合到基因組上的抗性基因KanMX去除。用此方法分別構(gòu)建得到不含抗性基因的改造菌株α-ALD2、α-ALD3、α-ALD4、α-ALD5、α-ALD6。

1.3.2 生長曲線的測定[15]

采用比濁法測定，首先從斜面挑取一環(huán)酵母菌接入裝液量為50 mL/250 mLYEPD的錐形瓶中，30 ℃靜置培養(yǎng)12 h。先取1 mL菌體接入裝液量為100 mL/250 mL YEPD的錐形瓶中，然后再適當(dāng)接入菌體調(diào)節(jié)初始OD600nm值為0.2，30 ℃靜置培養(yǎng)。每隔1 h取1 mL菌體，以空白培養(yǎng)基為對照，測定其在波長600 nm處的吸光度值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長曲線。

1.3.3 檢測方法

CO2排放量、還原糖和酒精度的測定分別采用稱質(zhì)量法[16]、斐林試劑法[17]和酒精計比重法[18]；乙酸含量的測定[19]：采用高效液相色譜法（HPLC）；高級醇含量的測定[20]：采用氣相色譜法。

1.3.4 發(fā)酵實驗

（1）發(fā)酵種子液的制備

一級種子液的制備：用接種環(huán)取一環(huán)酵母菌泥接種到含5 mL一級種子液的試管中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，每一株菌三個平行。

二級種子液的制備：取培養(yǎng)后的一級種子液5 mL接入裝液量為45 mL/150 mL含二級種子液的錐形瓶中，30 ℃靜置培養(yǎng)18～24 h。

（2）黃酒發(fā)酵工藝[15，21]

麥曲黃酒發(fā)酵工藝流程：

工藝A：黍米→清洗、浸泡→蒸煮→攤晾冷卻→培菌糖化（接菌、拌曲）→補水發(fā)酵

工藝B：大米→清洗、浸泡→蒸煮→攤晾冷卻→培菌糖化（接菌、拌曲）→補水發(fā)酵

操作要點：以米與水質(zhì)量比1∶15常溫浸泡原料18～20 h，用高壓電飯煲蒸0.5 h（原料米與水質(zhì)量比1∶1），以無生淀粉（米粒內(nèi)無白心），均勻一致為標(biāo)準(zhǔn)，蒸煮后攤晾冷卻至30 ℃。二級種子液接種量為10%、麥曲添加量為15%。培菌糖化24 h后，按照原料米與水質(zhì)量比1∶1補水，30 ℃靜置發(fā)酵7 d。

根霉曲黃酒發(fā)酵工藝流程：

工藝C：大米→清洗、浸泡→蒸煮→攤晾冷卻→培菌糖化（接菌、拌曲）→補水發(fā)酵

工藝D：大米→清洗、浸泡→蒸煮→攤晾冷卻→培菌糖化（拌曲）→補水發(fā)酵（接菌）

操作要點：工藝C流程與工藝A、B相同，工藝D拌曲培菌糖化24 h后接菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醛脫氫酶基因過表達菌株的構(gòu)建與驗證

圖2 改造菌株的PCR定點驗證Fig.2 PCR verification of modified strains

按照1.3.1中菌株構(gòu)建方法分別構(gòu)建乙醛脫氫酶基因過表達菌株，挑選疑似正確的轉(zhuǎn)化子進行PCR定點驗證，驗證結(jié)果見圖2。由圖2可知，PCR擴增產(chǎn)物堿基大小與預(yù)期相符，說明乙醛脫氫酶基因過表達菌株構(gòu)建成功。按照1.3.1中的方法去除抗性篩選標(biāo)記，最后得到改造菌株α-ALD2、α-ALD3、α-ALD4、α-ALD5、α-ALD6。

2.2 乙醛脫氫酶基因過表達對釀酒酵母生長性能的影響

出發(fā)菌株AY12α和改造菌株α-ALD2、α-ALD3、α-ALD4、α-ALD5、α-ALD6的生長曲線見圖3。由圖3可知，在0～6 h所有改造菌株的生長速率都略低于出發(fā)菌株，改造菌株α-ALD6最后的生物量也略有下降，其余改造菌株生物量沒有明顯變化。研究表明乙醛脫氫酶基因過表達對釀酒酵母生長性能影響不大，只有改造菌株α-ALD6生長性能有小幅降低。

圖3 出發(fā)菌株與改造菌株的生長曲線Fig.3 Growth curves of orginal strain and modified strains

2.3 乙醛脫氫酶基因過表達對釀酒酵母黃酒發(fā)酵的影響

傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵是以大米為原料，麥曲作糖化劑。所以本實驗首先采用工藝B對出發(fā)菌AY12α與改造菌株α-ALD2、α-ALD3、α-ALD4、α-ALD5、α-ALD6進行發(fā)酵實驗，以驗證乙醛脫氫酶基因過表達對釀酒酵母黃酒發(fā)酵的影響。

2.3.1 不同乙醛脫氫酶基因過表達對乙酸的影響

圖4 出發(fā)菌株與改造菌株的乙酸產(chǎn)量Fig.4 Acetic acid production of orginal strain and modified strains

乙醛脫氫酶可以氧化乙醛產(chǎn)生乙酸，出發(fā)菌與改造菌株的乙酸產(chǎn)量見圖4。由圖4可知，改造菌株α-ALD2、α-ALD3、α-ALD4、α-ALD5、α-ALD6的乙酸產(chǎn)量分別是出發(fā)菌AY12α的1.23倍、1.49倍、1.19倍、1.64倍和2.92倍。改造菌株α-ALD6乙酸產(chǎn)量上升最顯著（P＜0.01），菌株α-ALD5次之。此外，本研究也表明ALD6基因在乙醛產(chǎn)生乙酸過程中起著關(guān)鍵作用，這與之前的報道一致[22]。

2.3.2 不同乙醛脫氫酶基因過表達對高級醇的影響

出發(fā)菌與改造菌株的高級醇產(chǎn)量見圖5。由圖5可知，與出發(fā)菌AY12α相比，改造菌株高級醇產(chǎn)量都有所下降。其中改造菌株α-ALD6高級醇產(chǎn)量下降最顯著（P＜0.01），正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇和總高級醇產(chǎn)量分別降低了77.76%、67.61%、73.23%、67.87%和72.04%。改造菌α-ALD3分別降低了20.17%、19.88%、17.69%、11.00%和17.82%。改造菌α-ALD5分別降低了16.83%、18.90%、24.11%、14.92%和20.59%。改造菌高級醇產(chǎn)量明顯降低的原因一方面可能是因為高級醇的前體物質(zhì)醛類可以被乙醛脫氫酶氧化生成有機酸[23-24]，從而減少了經(jīng)醛類還原所產(chǎn)生的高級醇。另一方面可能與其乙酸含量顯著上升有關(guān)，因為在高濃度的乙酸存在下，釀酒酵母不能維持細胞質(zhì)膜電位的平衡，從而引起細胞的酸化，抑制了細胞的生長代謝[25]。而高級醇主要是伴隨釀酒酵母生長繁殖而產(chǎn)生，隨著酵母增殖倍數(shù)的增加而增加[9]，適當(dāng)提高乙酸含量可以抑制酵母生長從而降低高級醇含量，這與圖3中的生長性能相一致。因此，研究表明乙醛脫氫酶基因過表達可以降低黃酒中高級醇生成。

圖5 出發(fā)菌株與改造菌株的高級醇產(chǎn)量Fig.5 Higher alcohols production of original strain and modified strains

2.3.3 不同乙醛脫氫酶基因過表達對基本發(fā)酵性能的影響

發(fā)酵結(jié)束后測定出發(fā)菌和改造菌株的CO2排放量、酒精度和還原糖剩余量，結(jié)果見表3。

由表3可知，與出發(fā)菌AY12α相比，改造菌株α-ALD6的還原糖剩余量略高，且CO2排放量和酒精度也小幅下降。這可能與其乙酸含量顯著上升有關(guān)。乙酸抑制了酵母細胞的生長，影響了酵母的生長性能，最后影響到了酵母的基本發(fā)酵性能。有研究表明外源添加乙酸至1.5 g/L時，釀酒酵母在發(fā)酵過程中的生物量才會顯著下降（P＜0.01）[26]。由圖4可知，改造菌株α-ALD6的乙酸產(chǎn)量達1.02 g/L，因此可能會影響到菌體生長。不同種類黃酒中乙酸含量差別很大，通常乙酸含量在0.062～1.26 g/L[27]，酸可以賦予黃酒爽快和濃厚感。同時乙酸產(chǎn)量的提高也會使得酒體中的乙酸乙酯產(chǎn)量上升，賦予酒體果香[28]。之前的研究[11，21]通過提高改造菌的接種量來解決乙醛脫氫酶基因ALD6過表達改造菌發(fā)酵性能下降的問題，最后使改造菌的酒精度、還原糖剩余量和CO2排放量與出發(fā)菌株沒有差異，且降低高級醇效果沒有改變。而其余改造菌株只有還原糖剩余量高于出發(fā)菌，所有菌株的還原糖剩余量與酒精度都符合傳統(tǒng)型干黃酒的國標(biāo)要求[29]。因此乙醛脫氫酶基因過表達對釀酒酵母發(fā)酵性能影響不大，只有改造菌株α-ALD6的發(fā)酵性能有小幅降低。

表3 出發(fā)菌株和改造菌株基本發(fā)酵性能的比較Table 3 Comparison of basic fermentation performance of original strain and modified strains

2.4 不同發(fā)酵工藝下改造菌株乙酸和高級醇產(chǎn)量的變化

根據(jù)前述結(jié)果，選兩株降高級醇效果較好且乙酸產(chǎn)量高的改造菌株α-ALD5與α-ALD6。以出發(fā)菌株AY12α為對照，研究其在4種不同黃酒發(fā)酵工藝下的發(fā)酵性能、乙酸和高級醇產(chǎn)量的變化。在4種發(fā)酵工藝下改造菌株與出發(fā)菌的乙酸產(chǎn)量見圖6。

由圖6A可知，在所有工藝下，改造菌株均可顯著提高黃酒中乙酸含量（P＜0.01）。在A、B、C、D 4種工藝下，改造菌株α-ALD5的乙酸產(chǎn)量分別是出發(fā)菌的2.19倍、1.64倍、1.94倍和1.89倍，而改造菌株α-ALD6的乙酸產(chǎn)量分別是出發(fā)菌的3.68倍、2.92倍、3.02倍和2.95倍。說明改造菌株α-ALD6提高乙酸的效果強于菌株α-ALD5，這與圖4研究結(jié)果一致。

由圖6B可知，改造菌株在4種工藝下都可以顯著降低黃酒中高級醇含量（P＜0.01）。與出發(fā)菌AY12a相比，改造菌株α-ALD5在A、B、C、D 4種工藝下總高級醇產(chǎn)量分別降低了22.48%、20.59%、6.24%和17.52%，而改造菌株α-ALD6總高級醇產(chǎn)量分別降低50.67%、72.04%、15.52%和24.79%。此外，由于異戊醇含量在黃酒總高級醇中最高，是導(dǎo)致黃酒“上頭”的主要原因[4]。

由圖6C可知，與出發(fā)菌AY12a相比，改造菌株α-ALD5在A、B、C、D 4種工藝下異戊醇產(chǎn)量分別降低了25.55%、24.11%、9.26%和14.68%，而改造菌株α-ALD6分別降低54.43%、73.23%、17.82%和22.11%，且不同工藝下改造菌株的總高級醇和異戊醇下降趨勢基本一致。與純種根霉曲作糖化劑的工藝（工藝C和D）相比，改造菌株在以麥曲作糖化劑（工藝A和B）時降高級醇效果更好，且改造菌株α-ALD6在以大米加麥曲的工藝下高級醇含量下降最為顯著。這可能是因為麥曲中所含有的曲霉蛋白酶活力高于根霉曲中的根霉[30-31]，可快速將原料中的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生更多的氨基酸。而且改造菌株的生長性能相對出發(fā)菌稍弱，生長所需求的氨基酸相對較少，發(fā)酵液中相對較高的氨基酸導(dǎo)致改造菌株減少了自身氨基酸的合成，從而降低了由糖代謝途徑（高級醇的主要產(chǎn)生途徑）產(chǎn)生的高級醇[32-33]。與黍米相比，大米中淀粉含量相對較高，大米中淀粉含量約78%，而黍米的淀粉含量約70.6%～73.3%[34-35]，因此以大米為原料時，糖化產(chǎn)生的可發(fā)酵性糖含量較高，有利于強啟動子PPGK1調(diào)控乙醛脫氫酶基因的表達[36]（特別是乙醛脫氫酶家族最關(guān)鍵的ALD6基因），從而進一步降低高級醇產(chǎn)量。與工藝C相比，改造菌在工藝D下降高級醇效果更好，原因可能與上述分析相似，在沒有接種酵母前，沒有酵母的抑制，根霉繁殖較快并快速將原料中的淀粉和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為大量的可發(fā)酵性糖與氨基酸，較高的糖濃度有利于強啟動子PPGK1調(diào)控乙醛脫氫酶基因的表達，較高的氨基酸含量有利于進一步降低高級醇產(chǎn)量。綜上，改造菌株以麥曲作糖化劑時降高級醇效果更好，且改造菌株α-ALD6在以大米加麥曲的工藝下高級醇下降最為顯著。與改造菌株和純種根霉曲同時接種相比，改造菌株在培菌糖化24 h后接入降高級醇效果更好。

圖6 不同工藝下出發(fā)菌與改造菌株的乙酸（A）、總高級醇（B）及異戊醇（C）產(chǎn)量Fig.6 Acetic acid (A),Total higher alcohols (B) and isoamylol (C) production of original strain and modified strains under different processes

表4 不同工藝下出發(fā)菌株與改造菌株發(fā)酵性能的比較Table 4 Comparison of fermentation performance of original strain and modified strains under different processes

由表4可知，所有菌株在不同工藝下的還原糖剩余量與酒精度都符合傳統(tǒng)型干黃酒的國標(biāo)要求[29]。在工藝A的條件下改造菌株與出發(fā)菌株發(fā)酵性能沒有顯著差異。但在工藝B中，改造菌株α-ALD6的還原糖剩余量略有上升，CO2排放量和酒精度也有小幅下降，而改造菌株α-ALD5在此工藝下只有還原糖剩余量略有上升。在工藝B下改造菌株α-ALD6的發(fā)酵性能小幅下降。以純種根霉曲為糖化劑的工藝，改造菌株還原糖剩余量高于麥曲。一方面可能是因為純種根霉曲糖化力強于麥曲[32]，導(dǎo)致發(fā)酵過程中可發(fā)酵性糖含量較高，改造菌株無法完全利用發(fā)酵液中的可發(fā)酵性糖，因此最后還原糖剩余量顯著提高。另一方面可能是因為改造菌株以根霉曲作糖化劑發(fā)酵時最終乙酸含量最高有關(guān)。較高的乙酸使得酵母在發(fā)酵后期發(fā)酵力下降[26]，導(dǎo)致殘?zhí)鞘Ｓ嗔枯^高。結(jié)果表明，在以大米加麥曲的工藝下，改造菌株α-ALD6的發(fā)酵性能有小幅下降。改造菌株在以純種根霉曲作糖化劑時還原糖剩余量上升顯著。

3 結(jié)論

本研究以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）單倍體菌株AY12α為出發(fā)菌，利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了5株乙醛脫氫酶基因過表達菌株（ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6），在大米加麥曲的傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵工藝下，所有改造菌株均可以促進乙酸、降低高級醇的生成，其中改造菌株α-ALD6效果最顯著（P＜0.01），乙酸產(chǎn)量是出發(fā)菌AY12α的2.92倍，總高級醇產(chǎn)量下降72.04%。在不同發(fā)酵工藝中，改造菌株α-ALD5與α-ALD6均可顯著促進乙酸、降低高級醇生成（P＜0.01）；在純種根霉曲做糖化劑的發(fā)酵工藝中，改造菌株在培菌糖化24 h后接入降高級醇效果更好。與純種根霉曲相比，改造菌株以麥曲作糖化劑時降高級醇效果更好，且改造菌株α-ALD6在大米加麥曲的傳統(tǒng)黃酒發(fā)酵工藝下降高級醇效果最好。