生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪微生物多樣性研究

方月月，解文利，潘肇儀，吳雨桐，周禮紅

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

生姜獼猴桃酒是以生姜、獼猴桃為原料，添加一定量白砂糖，以自身附著的微生物在常溫條件下自然靜置發(fā)酵獲得的產(chǎn)品。利用微生物對果蔬混合物進(jìn)行發(fā)酵，不僅不會破壞原有的營養(yǎng)物質(zhì)，而且會使原有的營養(yǎng)物質(zhì)成倍增加[1]。在發(fā)酵過程中，生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪含有多樣性的微生物，包括酵母、細(xì)菌等。酵母是發(fā)酵過程中重要的功能微生物，影響各種發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量[2-4]。

酵母菌是一類真核生物，普遍存在于自然界中。在自然界中目前已發(fā)現(xiàn)了1 500多種酵母菌，在比較權(quán)威的荷蘭微生物菌種保藏中心保藏的酵母菌種類有900種[5]。酵母用于食品和飲料發(fā)酵已經(jīng)上千年，每種特定的發(fā)酵過程都有許多不同的酵母菌株，因此許多研究者分析了不同發(fā)酵產(chǎn)品中酵母菌的多樣性，結(jié)果表明，不同的發(fā)酵食品酵母菌的分布種屬各不相同。蔡燕麗等[6]采用傳統(tǒng)分離方法和現(xiàn)代非培養(yǎng)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）對不同發(fā)酵劑中酵母進(jìn)行了研究。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離得到的酵母菌5種，分別是釀酒酵母、異常威克漢姆酵母、扣囊復(fù)膜孢酵母、德爾布有孢圓酵母和布拉迪酵母。采用PCR-DGGE技術(shù)檢測到酵母有3種，包括釀酒酵母、異常威克漢姆酵母和扣囊復(fù)膜孢酵母。武俊瑞[7]通過選擇性純培養(yǎng)技術(shù)方法，從43份傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品中，分離篩選出93株酵母菌疑似菌株，進(jìn)一步采用26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析對各菌株屬種進(jìn)行鑒定。朱雯娟[8]通過對樣品16S rDNA V4可變區(qū)的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果，進(jìn)行發(fā)酵梅香魚微生物多樣性分析，結(jié)果表明，8個門被檢測到，分別是酸桿菌門、放線菌門、脫鐵桿菌門、厚壁菌門、浮霉菌門、變形菌門、柔膜菌門、及疣微菌門，厚壁菌門是優(yōu)勢菌門。其中乳桿菌屬、葡萄球菌屬和四聯(lián)球菌屬在梅香魚發(fā)酵中屬于優(yōu)勢菌屬。

目前關(guān)于果蔬發(fā)酵以傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝生產(chǎn)為主，受到環(huán)境中微生物、發(fā)酵體系和季節(jié)等條件影響大，容易受到雜菌的污染，發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量難以保證[9-11]。傳統(tǒng)發(fā)酵方式生產(chǎn)的生姜獼猴桃酒是以生姜、獼猴桃為水果原料（氮源），添加大量白砂糖（碳源），僅利用原料自身附著的微生物在常溫環(huán)境下發(fā)酵而制成。因此，為了研究生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪中的酵母菌系多樣性，本實驗采用常規(guī)培養(yǎng)基、寡營養(yǎng)培養(yǎng)基以及模擬環(huán)境培養(yǎng)基從生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪中分離酵母菌株，并對生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪酵母菌區(qū)系進(jìn)行多樣性研究和生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪不同時期酵母菌多樣性進(jìn)行分析。研究結(jié)果有助于提高生姜獼猴桃酒的質(zhì)量和風(fēng)味，為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

生姜、獼猴桃：市售；生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪：實驗室自制。

1.1.2 化學(xué)試劑

無水乙醇（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；引物（ITS 1/ITS 4）：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；酵母脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、（2×）TaqPCR Master Mix、4S green核酸染色劑、DNA Marker：上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基[12]

麥芽膏酵母膏蛋白胨葡萄糖（malt yeast extract peptone glucose，MYPG）瓊脂培養(yǎng)基：麥芽浸膏3 g，酵母浸膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。121 ℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨20.0 g，酵母浸膏10.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6。121 ℃滅菌20 min。

WL培養(yǎng)基：酵母浸膏4.0 g，胰蛋白胨5.0 g，葡萄糖50.0 g，磷酸二氫鉀0.55 g，氯化鉀0.425 g，氯化鈣0.125 g，硫酸鎂0.125 g，氯化鐵0.002 5 g，硫酸錳0.002 5 g，瓊脂20.0 g，調(diào)節(jié)pH至6.5。加入溴甲酚綠22.0 mg，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌20 min。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：麥芽浸膏20.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，加熱溶于適量水中，蒸餾水1 000 mL，pH自然。115 ℃滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：200 g去皮馬鈴薯，切成薄片，加入1 L水，煮沸20 min后用紗布過濾。加入20.0 g葡萄糖、15.0 g瓊脂，加熱溶于適量水中，定容至1 000 mL。pH自然。121 ℃滅菌20 min。

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g，瓊脂20.0 g，加熱溶于適量水中，加入1/3 000孟加拉紅溶液100 mL。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培養(yǎng)基中，定容至1 000 mL。pH自然。分裝后121 ℃滅菌20 min。

酵母粉麥芽糖（yeast maltose，YM）培養(yǎng)基：酪蛋白胨5.0 g，麥芽浸膏3.0 g，葡萄糖10.0 g，瓊脂20.0 g，加熱溶于適量水中，調(diào)節(jié)pH至6.0。定容至1 000 mL。分裝后115 ℃滅菌30 min。

水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂粉20.0 g，加熱溶于適量蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7，定容至1 L。分裝后121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

S1000 PCR擴增儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司；ABI 3730XL全自動DNA測序儀：美國ABI公司；AllegraX-30RCentrifuge離心機：美國BECKMAN COULTER公司；HWS-250B恒溫恒濕培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；GM-K30打漿機：佛山市順德區(qū)格明電器實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪的制備

生姜、獼猴桃去雜、去壞果，將獼猴桃和生姜清洗后鹽水浸泡30 min之后去皮，混合打漿，加入30%的白砂糖后裝瓶，在（25±1）℃的溫度下自然發(fā)酵，生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪分為發(fā)酵初期（plot1）（10 d），發(fā)酵中期（plot2）（45 d），發(fā)酵后期（plot3）（90 d）3個時期。

1.3.2 酵母菌的分離

取生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪自然發(fā)酵初、中、后3個時期（即發(fā)酵第10天、45天、90天）的發(fā)酵醪樣品10 g，放入盛有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩5 min，充分搖勻，稀釋制成10-1菌懸液。將制得的菌懸液梯度稀釋[12]。分別吸取濃度梯度為10-3、10-4、10-5的菌液100 μL至倒好的平板上。（28±1）℃靜置培養(yǎng)2 d，根據(jù)菌落大小、形態(tài)、顏色、表面的粗細(xì)、透明圈、粘稠度、高低、邊緣的形狀、菌塊的質(zhì)地等表型特征挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到相應(yīng)培養(yǎng)基斜面，（28±1）℃靜置培養(yǎng)2 d，用于菌體的制備。

1.3.3 酵母菌5.8S rDNA ITS區(qū)序列分析

（1）菌體制備

將于（28±1）℃靜置培養(yǎng)24 h左右的酵母斜面菌種，用無菌水洗下菌苔，加入到滅菌離心管中，以10 000 r/min的速度離心15 s，將酵母菌體沉淀物再用無菌水洗滌2次后用于模板制備。

（2）DNA模版制備

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按照說明書方法進(jìn)行抽提。

（3）5.8S rDNA ITS PCR擴增

以ITS 1（5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'）、ITS 4（5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'）為引物，以酵母菌總DNA為模板進(jìn)行PCR擴增。在PCR擴增管中加入DNA模版1 μL，2×Mix13 μL，10 μmol/LITS1 1 μL，10 μmol/L ITS2 1 μL，蒸餾水9 μL，混勻后進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性4 min后，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，再72 ℃延長10 min。

（4）測序方法

DNA測序采用雙脫氧終止法。

（5）序列分析

利用DNAman軟件拼接序列，啟動Seqman，導(dǎo)入目標(biāo)序列（峰圖文件），進(jìn)行數(shù)據(jù)修正，采用美國國家生物技術(shù)信息中心（nationalcenter for biotechnologyinformation，NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫，下載得分高、序列相似性達(dá)到95%以上相關(guān)酵母菌株5.8S rDNA ITS序列，選擇的菌株盡可能來源于保藏機構(gòu)。采用MEGA10.0.5軟件進(jìn)行序列比對及聚類分析。

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法：利用MEGA10.0.5軟件的鄰接（neighbor-joining，NJ）法重構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹，采用bootstrap檢驗進(jìn)行評估，bootstrap檢驗1 000次。在不同種類的細(xì)菌菌株中選取代表菌株，采用NJ法將每一類代表菌株序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的模式菌株序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得分離菌株的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育地位[13-15]。

1.3.4 不同時期生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪多樣性分析

利用R語言（R version 3.5.3），使用Vegan包（Vegan 2.5～4.0）進(jìn)行生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪初期、中期、后期的酵母菌群的α多樣性分析。分析三個不同發(fā)酵階段的Shannon-Wiener指數(shù)、Inverse Simpson指數(shù)、Simpson指數(shù)、物種累計數(shù)、均勻度指數(shù)。使用Rattle包（Rattle XXXX 5.2.0）進(jìn)行生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪初期、中期、后期的酵母菌群的菌群之間的相關(guān)性分析。在https：//cloud.tencent.com/developer/article/1474392網(wǎng)頁中進(jìn)行生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪初期、中期、后期的酵母菌群的β多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪期間的酵母菌

圖1 318株酵母菌株基于5.8S rDNA ITS區(qū)基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the 318 yeast strains based on 5.8S rDNA ITS region gene sequence

從生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵前期、中期和后期中共分離得到318株酵母菌株，通過對酵母菌株5.8S rDNA序列進(jìn)行測序，并利用MEGA軟件對5.8S rDNA序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知，318株酵母菌株分別聚成了12個不同的獨立類群，每個類群進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析，每個類群的菌株分別和數(shù)據(jù)庫里已知的菌株以95%的相似性聚在一起，12個獨立的類群可能歸屬于12個種。12個獨立的類群每一類群選擇1個或2個菌株作為代表菌株進(jìn)行序列比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位和系統(tǒng)發(fā)育地位，其中選取的酵母菌的代表菌株號分別為290、186（2）、186（3）、136、240、356、452、394、112、1、283、36、208-2、378。

2.2 12個酵母菌類群的鑒定

采用NJ法重建系統(tǒng)發(fā)育樹將酵母菌的代表菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果分別見圖2和圖3。

圖2 酵母菌株基于5.8S rDNA ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of yeast strains based on 5.8S rDNA ITS gene sequence

由圖2可知，菌株3-1被鑒定為膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens），菌株290、186（2）、186（3）被鑒定為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri），菌株136被鑒定為梅奇酵母（Metschnikowia ziziphicola），菌株240被鑒定為奧莫柯達(dá)酵母（Kodamaea ohmeri），菌株356被鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），菌株452被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），菌株394和菌株112被鑒定為異常畢赤酵母（Wickerhamomyces anomalus），菌株1被鑒定為卡利比克邁耶氏酵母（Meyerozyma caribbica），菌株283被鑒定為德巴利酵母（Debaryomyces nepalensis），菌株36被鑒定為桔假絲酵母（Candida quercitrusa）。其中Myerozyma是由KURTZMAN C P等[16]在對能夠產(chǎn)生輔酶Q-9的Debaryomyces、Lodderomyces、Spathaspora、Yamadazyma屬酵母以及Pichia、Candida酵母屬部分酵母進(jìn)行了26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析和系統(tǒng)發(fā)育研究后提出的新屬，并將Pichia carribica歸于此屬，稱為Myerozyma caribbica[17-18]。

由圖3可知，菌株208-2被鑒定為假絲酵母（Candida carpophila），菌株378被鑒定為奧莫柯達(dá)酵母（Kodamaea ohmeri）。

圖3 菌株208-2和378基于5.8S rDNA ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 208-2 and 378 based on 5.8S rDNA ITS gene sequences

2.3 不同時期生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪中酵母菌群α多樣性分析

2.3.1α多樣性分析

統(tǒng)計不同時期酵母菌株，結(jié)果見表1，不同時期酵母菌株通過R語言可視化結(jié)果見圖4。

表1 不同發(fā)酵時期酵母菌株的分布Table 1 Distribution of yeast strains in different fermentation periods

圖4 不同組間酵母菌群α多樣性指數(shù)差異Fig.4 Differences in α diversity indices of yeast strains between different groups

由圖4可知，在生姜獼猴桃酒發(fā)酵的不同時期，Shannon-Wiener指數(shù)表明生姜獼猴淘酒發(fā)酵后期物種多樣性較高，中期較低，綜合考慮Inverse Simpson 指數(shù)和Simpson指數(shù)，物種多樣性發(fā)酵中期＞發(fā)酵前期＞發(fā)酵后期。物種累計數(shù)（S）表明，生姜獼猴桃酒發(fā)酵后期的物種累計數(shù)較高。Pielou均勻度指數(shù)顯示，發(fā)酵前期的物種均一度最高，發(fā)酵后期的物種均一度較低，發(fā)酵中期的物種均一度最低。

2.3.2β多樣性分析

Venn圖可用于統(tǒng)計多個樣品中所共有的和獨有的酵母菌數(shù)目。3個不同發(fā)酵階段之間的酵母菌的差異情況見圖5。

由圖5可知，發(fā)酵后期（plot3）酵母菌數(shù)目與獨有酵母菌數(shù)目最多，物種豐富度最高。發(fā)酵前期（plot1）和發(fā)酵中期（plot2）酵母菌數(shù)目與獨有酵母菌數(shù)目相似。發(fā)酵前期（plot1）、發(fā)酵中期（plot2）、發(fā)酵后期（plot3）共有的酵母菌數(shù)為2個，發(fā)酵前期（plot1）和發(fā)酵中期（plot2）共有的酵母菌株為1個，發(fā)酵前期（plot1）和發(fā)酵后期（plot3）共有的酵母菌數(shù)為1個。

圖5 不同發(fā)酵時期物種多樣性的韋恩圖分析Fig.5 Analysis of Venn diagram of diversity of species in different fermentation periods

3 討論

酵母在發(fā)酵的過程中能產(chǎn)生不同的代謝物質(zhì)，研究表明Debaryomyces nepalensis產(chǎn)生乙醇、甘油、阿拉伯糖醇和木糖醇代謝物[19]。畢赤酵母（Pichia stipitis）、假絲酵母（Candida shehatae）和嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus）的酵母菌株能夠?qū)⑵咸烟呛湍咎前l(fā)酵成乙醇和木糖醇等代謝物質(zhì)[20]。經(jīng)全球代謝物譜分析表明釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可以產(chǎn)生丙酮酸、鳥氨酸-1,5-內(nèi)酰胺、纈氨酸、天冬氨酸、正亮氨酸、甘氨酸、賴氨酸、呋喃-2-羧酸、天冬酰胺和甘氨酰-脯氨酸等代謝物質(zhì)[21]。在發(fā)酵中產(chǎn)生的代謝物質(zhì)將影響發(fā)酵食品的風(fēng)味，例如代謝物質(zhì)有機酸、二乙酰，來自支鏈氨基酸的高級醇和由其衍生的酯等。

通過微生物可培養(yǎng)分析生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪中的酵母菌群多樣性，了解生姜獼猴桃發(fā)酵過程中酵母菌系多樣性有助于分析之后發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物來源。為生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪安全評估提供理論基礎(chǔ)，為之后果蔬發(fā)酵機制研究提供一定的理論基礎(chǔ)和意義。

4 結(jié)論

通過5.8S rDNA ITS序列進(jìn)行多序列比對分析方法對生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪進(jìn)行酵母菌多樣性分析得出，在分離的318株酵母菌株中，12個細(xì)菌類群分屬于8屬11種，包括膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens），克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri），梅奇酵母（Metschnikowia ziziphicola），奧莫柯達(dá)酵母（Kodamaea ohmeri），葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），異常畢赤酵母（Wickerhamomyces anomalus），Meyerozyma caribbica，德巴利酵母（Debaryomyces nepalensis），桔假絲酵母（Candida quercitrusa），假絲酵母（Candida carpophila），說明果蔬自然發(fā)酵過程中存在豐富的酵母菌群。

通過對生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪的不同時期進(jìn)行多樣性分析，α多樣性分析結(jié)果顯示，生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪發(fā)酵中期的酵母多樣性最高，發(fā)酵后期的物種累計數(shù)較高，發(fā)酵前期的物種均一度最高。β多樣性分析結(jié)果顯示生姜獼猴桃自然酒精發(fā)酵醪中發(fā)酵后期的物種豐富度最高，三個發(fā)酵階段共有的酵母菌菌數(shù)為2個。