南寧地區(qū)米酒曲中酵母菌的分離鑒定及其在紅棗酒中的應(yīng)用

崔夢君，席 啦，朱妞妞，單春會(huì)，鐘小丹，趙慧君，郭 壯

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽 441053；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000；3.湖北米婆婆生物科技股份有限公司，湖北孝感 432003）

果酒是以水果為原料，在酵母菌的作用下，將水果中自身含有及外源加入的糖分轉(zhuǎn)化為酒精而制成的一類發(fā)酵酒[1]。因不僅具有水果的清香，同時(shí)含有對(duì)人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)，果酒深受廣大消費(fèi)者的喜愛。果酒加工也被認(rèn)為是提高農(nóng)產(chǎn)品附加值和延長水果種植產(chǎn)業(yè)鏈的有效方式之一。然而目前我國果酒加工使用的發(fā)酵劑呈現(xiàn)出產(chǎn)品單一且菌株多來源于國外的不足，在一定程度上限制了我國果酒行業(yè)的發(fā)展[2]。作為我國特色發(fā)酵酒，白酒、黃酒和米酒釀造時(shí)均需使用酒曲，酒曲的微生物群系較為復(fù)雜，除含有乳酸菌和霉菌外，亦含有大量的酵母菌[3]，因而從中分離、保藏并篩選酵母菌用于果酒加工具有較強(qiáng)的可行性。

米酒曲中的酵母菌多樣性較高且種系獨(dú)特，尤其是蘊(yùn)含了大量的扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[4]。作為果酒發(fā)酵中最常用的菌株，S.cerevisiae廣泛應(yīng)用于葡萄、獼猴桃和荔枝等果酒的釀造[5]。雖然國內(nèi)應(yīng)用尚少，但S.fibuligera的高產(chǎn)酯能力、高糖化力和高蛋白酶活性決定了其在制酒工業(yè)中具有較大的應(yīng)用潛力[6]。紅棗在我國的種植面積超2 000萬畝，年產(chǎn)量近千萬噸，具有糖分高且香味濃郁的特點(diǎn)，較為適合果酒的加工[7]。研究表明，紅棗酒中富含的氨基酸不僅具有較高的營養(yǎng)價(jià)值且能影響果酒滋味品質(zhì)的形成[8]。亦有研究表明，不同酵母菌菌株在果酒中的代謝差異較大，且這種差異直接影響了果酒的風(fēng)味品質(zhì)[9]。

本研究對(duì)廣西省南寧市米酒曲中的酵母菌進(jìn)行了分離鑒定，選取其中的S.cerevisiae和S.fibuligera進(jìn)行了紅棗酒制備，同時(shí)采用氨基酸分析儀和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）對(duì)其氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量進(jìn)行了解析，以期為后續(xù)紅棗果酒發(fā)酵劑的研制提供菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駿棗（Jun jujube）：購于新疆維吾爾自治區(qū)石河子市；白砂糖：柳州市柳冰食品廠；偏重亞硫酸鉀：意大利ESSECO集團(tuán)；果膠酶（50 000 U/g）：和氏璧生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：北京博奧星生物技術(shù)有限公司；十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、酚、氯仿、異戊醇、乙酸鈉、乙醇和乙二胺四乙酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚合酶、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖溶液、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）混合液、2×PCR混合液和pMD18-T克隆載體：大連寶生物技術(shù)有限公司；正向引物（NS1：5'-CATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和反向引物（NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；PCR清潔試劑盒：北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli）top10：鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所保存；氨基酸分析儀配套緩沖溶液：英國Biochrom公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti FAST梯度PCR儀：美國ABI公司；9231破壁榨汁機(jī)：奧克斯集團(tuán)有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；QYC-2102C全溫培養(yǎng)搖床：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Biochrom 30+氨基酸分析儀：英國Biochrom公司；GCMS-QP2020氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：島津企業(yè)管理中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

從廣西省南寧市淡春菜市場、官塘綜合市場和北湖農(nóng)貿(mào)市場采集米酒曲樣品10 份，所有米酒曲均無蟲蛀和發(fā)霉現(xiàn)象，均在南寧市本地制作和銷售。

1.3.2 酵母菌的分離、純化和鑒定

使用研缽將米酒曲粉碎，取1 g加入99 mL生理鹽水中，錐形瓶置于搖床25 ℃振蕩30 min后按照10 倍梯度進(jìn)行倍比稀釋，取10-3～10-53個(gè)梯度的菌懸液涂布于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃有氧恒溫培養(yǎng)2～5 d，挑選具有典型酵母菌形態(tài)特征的菌落進(jìn)行純化和凍藏。采用消解酶-氯化芐法進(jìn)行酵母菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取[10]，PCR擴(kuò)增體系：10×PCR 緩沖液（含Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5mol/L）2μL，正向引物和反向引物各0.5μL，聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，DNA模板1 μL，無菌水18 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min[11]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、連接和轉(zhuǎn)化后，挑取陽性克隆子送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序，反饋回的序列與美國國家生物技術(shù)信息中心的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)進(jìn)而明確其種系型。

1.3.3 紅棗酒的制備

（1）紅棗清洗去核，按照1∶5的質(zhì)量比加入純水，同時(shí)加入總質(zhì)量0.006%（質(zhì)量比）的偏重亞硫酸鉀，打漿；（2）加入3%果膠酶，45 ℃酶解1 h；（3）酶解后紅棗汁的可溶性固形物含量約為13.0°Bx，用白砂糖將其調(diào)至22°Bx后，用酒石酸調(diào)pH值至3.9；（4）按照5×107CFU/mL紅棗漿的比例接入

1.3.2 中鑒定為扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的分離株，同時(shí)設(shè)置不添加酵母菌而自然發(fā)酵的樣品為對(duì)照組；（5）罐口采用4層紗布進(jìn)行封口，22 ℃恒溫發(fā)酵，為比較不同分離株的發(fā)酵特性，若有1 個(gè)分離株制備的樣品糖度72 h保持不變，則視為所有樣品發(fā)酵結(jié)束；（6）紅棗酒用紗布過濾后，濾液10 000 r/min離心6 min，上清備用[12]。

1.3.4 測定方法

紅棗酒酒精度的測定：使用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中約束的密度瓶法。

紅棗酒中氨基酸含量的測定：參照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》。使用Biochrom 30+氨基酸分析儀，配置磺酸型陽離子樹脂色譜柱進(jìn)行氨基酸含量和種類分析，溫度梯度38 ℃、50 ℃和93 ℃，檢測波長440 nm和570 nm，流速35 mL/h，緩沖液1、2、5和6分別洗脫9 min、12 min、20 min和6 min。

基于GC-MS對(duì)紅棗酒中揮發(fā)性物質(zhì)含量的測定：參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)含量測定，并進(jìn)行適當(dāng)修改。（1）取10 mL紅棗酒于20 mL樣品瓶，鋁帽封口；（2）H-Rtx-Wax色譜柱（30 m×2.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度200℃，高純氦氣（He）和氮?dú)猓∟2）為載氣（純度＞99.999 9%），分流比10∶1，流速1 mL/min；起始溫度30 ℃，保持3 min，以3 ℃/mm升至45 ℃，保持10 min，然后以8 ℃/min升至130 ℃，不保持，然后以10 ℃/min升至200 ℃保持7 min；（3）電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度230 ℃，連接口溫度280 ℃，電子轟擊能量70 eV；m/z范圍33.00～450 amu，采集方式Q3 Scan；（4）使用美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）14標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫根據(jù)化合物保留指數(shù)進(jìn)行定性分析，利用峰面積占總峰面積的比值對(duì)主要化合物進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用方差分析對(duì)紅棗酒酒精度差異性進(jìn)行分析；使用R軟件（V3.6.2）繪制氣泡圖；使用Origin2017軟件繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌分離鑒定

將本研究分離的酵母菌進(jìn)行26S rRNA測序，返回的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果如表1所示。

表1 分離酵母菌26S rRNA序列同源性比對(duì)結(jié)果Table 1 Result of homology comparison of 26S rRNA sequences of isolated yeast strains

由表1可知，20 株酵母菌與模式株參比序列同源性均在99%以上，被鑒定為5個(gè)屬的5個(gè)種，其中菌株HBUAS61051等10株菌被鑒定為扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），占分離株總數(shù)的50%；菌株HBUAS61054等5株菌被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），占分離株總數(shù)的25%；菌株HBUAS61059等3株菌被鑒定為弗比恩酵母（Cyberlindnera fabianii），占分離株總數(shù)的15%；菌株HBUAS61058和菌株HBUAS61072分別被鑒定為葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）和Yamadazyma mexicana，各占分離株總數(shù)的5%。由此可見，南寧地區(qū)米酒曲中酵母菌多樣性較高，且以S.fibuligera為主。

2.2 紅棗酒酒精含量的分析

本研究使用分離到的10 株S.fibuligera和5 株S.cerevisiae進(jìn)行了紅棗酒的制備，并以不接入酵母菌且自然發(fā)酵的樣品為對(duì)照，探討了其對(duì)紅棗酒酒精度、氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量的影響。紅棗酒酒精度如圖1所示。

圖1 不同菌株釀制的紅棗酒酒精度Fig.1 Alcohol contents of jujube wine brewed with different strains

由圖1可知，較之自然發(fā)酵，多數(shù)接種酵母菌釀造的紅棗酒酒精度均顯著提升（P＜0.05），其中S.fibuligeraHBUAS61053和S.cerevisiaeHBUAS61071釀造的紅棗酒酒精度最高，均為12.3%vol。而S.fibuligeraHBUAS61051、S.fibuligeraHBUAS61066和S.cerevisiaeHBUAS61070釀造的紅棗酒酒精度均約為7.5%vol，與自然發(fā)酵紅棗酒酒精度差異不顯著（P＞0.05）。由此可見，雖然接種酵母菌可縮短紅棗酒的發(fā)酵周期，但不同菌株間存在一定差異。

2.3 紅棗酒氨基酸種類和含量的分析

紅棗酒中氨基酸種類及含量如表2所示。由表2可知，接種酵母菌發(fā)酵的紅棗酒共檢測出必需氨基酸5種，非必需氨基酸7種，平均氨基酸總量為3271.93mg/L，其中必需氨基酸283.88 mg/L，非必需氨基酸2 988.05 mg/L；除酪氨酸外，自然發(fā)酵紅棗酒中共檢測出必需氨基酸5種，非必需氨基酸6 種，氨基酸總量為1 926.30 mg/L，其中必需氨基酸223.62 mg/L，非必需氨基酸1 702.68 mg/L。脯氨酸和天冬氨酸為2 種紅棗酒中的主要氨基酸，在接種酵母菌發(fā)酵的紅棗酒中平均含量分別為1 857.93 mg/L和771.59 mg/L，而在自然發(fā)酵紅棗酒中含量分別為1057.97mg/L和441.16mg/L。值得一提的是，必需氨基酸與氨基酸總量的比值在接種酵母發(fā)酵和自然發(fā)酵紅棗酒中分別為8.7%和11.6%，而必需氨基酸與非必需氨基酸的比值在2類紅棗酒中分別為9.5%和13.1%。由此可見，接種酵母菌釀造的紅棗酒中氨基酸種類和含量均明顯提升，但增量主要體現(xiàn)在脯氨酸和天冬氨酸等非必需氨基酸上。

表2 紅棗酒中氨基酸種類及含量Table 2 Types and contents of amino acids in jujube wine

由表2可知，丹陽封缸酒中必需氨基酸與氨基酸總量的比值為42.4%，而必需氨基酸與非必需氨基酸的比值高達(dá)73.6%。由此可見，紅棗酒中氨基酸總量明顯高于丹陽封缸酒，但其氨基酸種類較之丹陽封缸酒偏少，且主要以非必需氨基酸為主。本研究進(jìn)一步對(duì)紅棗酒中呈味氨基酸的構(gòu)成進(jìn)行了分析，結(jié)果如表3所示。

表3 紅棗酒中呈味氨基酸的構(gòu)成Table 3 Composition of flavor amino acids in jujube wine

由表3可知，接種酵母菌發(fā)酵和自然發(fā)酵的紅棗酒中甘味呈味氨基酸含量均最多，分別為1 319.33 mg/L和2 230.75 mg/L，占氨基酸總量的68.5%和68.2%；其次為酸味呈味氨基酸，含量分別為441.16 mg/L和771.59 mg/L，占氨基酸總量的22.9%和23.6%；而澀、苦和鮮味呈味氨基酸的含量均相對(duì)較少。由此可見，甘味和酸味呈味氨基酸為紅棗酒中主要呈味氨基酸，2 類紅棗酒中呈味氨基酸的構(gòu)成比例無明顯差異。由表3亦可知，丹陽封缸酒中甘味呈味氨基酸平均含量最高，占氨基酸總量的56.4%，其次為澀味和苦味呈味氨基酸，含量分別為19.6%和14.9%，而酸味和鮮味呈味氨基酸均較少。由此可見，紅棗酒和丹陽封缸酒在呈味氨基酸構(gòu)成上存在明顯的差異。

2.4 紅棗酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量的分析

果酒中通常含有多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[16]，其中醇類化合物在果酒中主要發(fā)揮呈香呈味的作用，對(duì)果酒的香氣和味道形成有著重要影響[17]；酯類化合物是酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，乙酸乙酯和己酸乙酯等酯類化合物具有明顯的果香特性[18-19]；醛類化合物多源于醇類的氧化或酸類物質(zhì)的還原，亦是果酒的重要呈味物質(zhì)[20]。紅棗酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量的分析如表4所示。

由表4可知，峰圖中約有80%左右的化合物可以被鑒定，2類紅棗酒共檢測出40種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類25種，醇類9種，醛類5種和胺類1種。酵母菌發(fā)酵紅棗酒共檢測出35種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類、醇類和醛類物質(zhì)分別為22種、8種和4種，平均相對(duì)含量依次為13.26%、50.72%和13.20%；自然發(fā)酵紅棗酒共檢測出28 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類、醇類和醛類物質(zhì)分別為21種、4種和3種，相對(duì)含量依次為8.04%、62.04%和2.94%。由此可見，接種酵母菌發(fā)酵可提升紅棗酒中酯類物質(zhì)的相對(duì)含量。紅棗酒中相對(duì)含量大于1.0%揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的氣泡圖如圖2所示。

表4 紅棗酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中化合物的種類數(shù)量Table 4 Types and numbers of volatile flavor compounds in jujube wine

圖2 紅棗酒中平均相對(duì)含量＞1.0%揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的氣泡圖Fig.2 Bubble chart of volatile flavor substances in jujube wine with average relative content more than 1.0%

由圖2可知，紅棗酒中有8 類化合物的平均相對(duì)含量大于1.0%，其中酯類2 種、醇類4 種和醛類2 種。異戊醇和乙酸乙酯為酵母菌發(fā)酵紅棗酒中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，平均相對(duì)含量分別為33.03%和24.37%，兩者亦為自然發(fā)酵紅棗酒中的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，平均相對(duì)含量分別為18.91%和51.34%。

3 結(jié)論

南寧地區(qū)米酒曲中酵母菌多樣性較高，且以S.fibuligera為主。使用S.fibuligera和S.cerevisiae分離株進(jìn)行紅棗酒制備發(fā)現(xiàn)，脯氨酸和天冬氨酸為紅棗酒中的主要氨基酸，甘味和酸味氨基酸為主要呈味氨基酸，異戊醇和乙酸乙酯為主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。較之自然發(fā)酵，接種酵母菌發(fā)酵可縮短紅棗酒的發(fā)酵周期，提升脯氨酸和天冬氨酸等非必需氨基酸的含量，同時(shí)提升紅棗酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中酯類化合物的相對(duì)含量。