響應面法優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵蘋果漿工藝及其抗氧化活性分析

袁 晶，康三江，宋 娟

（甘肅省農業(yè)科學院農產品貯藏加工研究所，甘肅蘭州 730070）

隨著社會發(fā)展和生活水平的提高，人們越來越趨于消費綠色新鮮、安全營養(yǎng)、益生健康的功能食品，非酒精發(fā)酵果蔬飲品日益受到消費者關注[1]。益生菌是指通過攝入適當的量，對食用者有健康益處的活的微生物[2]，具有抑菌消炎[3]、增強機體免疫力[4]、抗腫瘤[5-6]等功效。目前人們獲取益生菌主要途徑是通過攝入發(fā)酵乳制品，SILANIKOVE N等[7]研究發(fā)現全球約有75%的人存在乳糖不耐受癥狀，同時乳制品還有膽固醇含量過高、牛奶蛋白過敏等缺陷，很大程度限制了人們獲取益生菌[8]。蘋果營養(yǎng)全面且均衡，富含碳水化合物、有機酸、維生素和礦物質元素等[9]，大量研究表明，蘋果可作為益生菌發(fā)酵的良好基質[10-12]。

本研究利用植物乳桿菌發(fā)酵蘋果全果漿，充分保留蘋果全果的營養(yǎng)物質，并通過超聲波-酶法的預處理方式，利用酶反應高效且專一的特點，促進大分子果膠、膳食纖維、淀粉等營養(yǎng)物質分解成小分子并溶出[13-16]，最大程度提高蘋果漿生物利用率。在單因素試驗的基礎上，以活菌數和感官評分為響應值，結合響應面法優(yōu)化蘋果漿發(fā)酵工藝條件，通過比較發(fā)酵前后抗氧化活性的變化，為開發(fā)一種綠色營養(yǎng)、健康保健的發(fā)酵蘋果漿提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果：品種為“紅富士”，甘肅省慶陽市；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC 21824：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

MRS肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂（生化試劑）：美國Solarbio公司；纖維素酶（20萬U/g）、果膠酶（30萬U/g）：寧夏和氏璧生物技術有限公司；鐵離子還原能力試劑盒（ferric reducing antioxidant power，FRAP）：蘇州科銘生物技術有限公司；2,2'-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzthiazo-line-6-sulfonic acid），ABTS）檢測試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BSA224S-CW電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；UV4802型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；BL-75G型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SC-298型立式菌種保藏柜：青島海爾股份有限公司；HR2096型飛利浦攪拌機：飛利浦電子（香港）有限公司；HH-S4電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；TGL-16MC冷凍離心機：長沙維爾康湘鷹離心機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

取甘油保存的植物乳桿菌菌液于MRS固體培養(yǎng)基上劃線活化，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取長勢較好的單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中擴培，活化1～2次。充分活化后的菌液4 000 r/min離心10 min，取沉淀用生理鹽水（0.9%氯化鈉無菌水溶液）溶解，同時進行菌落計數，備用。

1.3.2 超聲波-酶法預處理蘋果漿

新鮮蘋果清洗后去核、打漿，快速加入0.06%（w/w）Na2SO3攪拌均勻，加入復合酶（纖維素酶∶果膠酶=1∶1，0.07%）后超聲處理（200 W，10 min，55 ℃），置于55 ℃水浴中繼續(xù)酶解50 min。酶解結束后，用NaOH溶液（3 mol/L）調整蘋果漿pH為5.0，于121 ℃滅菌10 min[17]迅速冷卻待用。

1.3.3 發(fā)酵

將重懸后的植物乳桿菌接入上述蘋果漿中，34 ℃靜置發(fā)酵72 h后，得發(fā)酵蘋果漿，取樣測定指標。

1.3.4 單因素試驗

設定接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%（V/V），發(fā)酵溫度分別為28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃，發(fā)酵時間分別為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h，考察接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間對蘋果漿發(fā)酵的影響。

1.3.5 Box-Behnken中心組合試驗設計

為確定蘋果漿最佳發(fā)酵工藝參數，依據單因素試驗結果，選擇接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為影響因素，以活菌數和感官評分為響應值，根據Box-benhnken中心組合設計原理，運用Design-Expert 8.6.0.1軟件設計響應面試驗，因素與水平見表1。

表1 蘋果漿發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for apple pulp fermentation conditions optimization

1.3.6 測定方法

（1）活菌數、可滴定酸和感官評價測定

活菌數采用GB4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》中的傾注平板計數法測定?？傻味ㄋ釁⒄誈B 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法測定。

感官評價采用9分制的評分方法[18]，滿分36分。邀請9名具有食品發(fā)酵相關專業(yè)知識背景的老師對發(fā)酵蘋果漿進行感官品評，評分細則詳見表2。

表2 發(fā)酵蘋果漿感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermented apple pulp

（2）總抗氧化活性測定

鐵離子還原能力、ABTS自由基清除能力的測定均采用試劑盒法。鐵離子還原能力單位為U/mL，ABTS自由基清除能力以1 mL樣品中的Trolox等效抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）表示，單位為μmol Trolox/mL。

1.3.7 數據統(tǒng)計分析

所有試驗均重復3次，數據處理和顯著性差異分析采用Origin2018和SPSS24.0軟件，實驗設計和數據處理采用Design-Expert 8.0.6.1軟件。

2 結果與分析

2.1 蘋果漿發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 接種量對發(fā)酵蘋果漿的影響

圖1 接種量對發(fā)酵蘋果漿活菌數、可滴定酸和感官評分的影響Fig.1 Effect of inoculum on viable cell count,titratable acidity and sensory evaluation of fermented apple pulp

如圖1所示，隨著乳酸菌接種量的增加，蘋果漿發(fā)酵體系中的活菌數呈現先增加后下降的趨勢。研究表明，接種量過高，發(fā)酵速度過快，過酸的環(huán)境和生存競爭反而會影響乳酸菌生長[19]，當接種量為10%時，其活菌數達到最大值8.68 lg（CFU/mL）。體系中可滴定酸隨著接種量的增加呈現逐步升高的趨勢，但發(fā)酵過快產酸過多會影響感官品評，當接種量為10%時感官評分達到最大值。因此，選擇接種量為8%、10%和12%。

2.1.2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵蘋果漿的影響

圖2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵蘋果漿活菌數、可滴定酸和感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on viable cell count,titratable acidity and sensory evaluation of fermented apple pulp

如圖2所示，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵體系的活菌數、可滴定酸和感官評分均呈現先上升后降低的趨勢。31 ℃、34 ℃、37 ℃均適宜乳酸菌發(fā)酵，當發(fā)酵溫度為34 ℃時，體系中活菌數達到最大值8.65 lg（CFU/mL）。隨著發(fā)酵溫度的繼續(xù)升高，體系中活菌數、可滴定酸和感官評分均呈現下降趨勢，說明該條件已不適宜乳酸菌生長代謝。因此，選取發(fā)酵溫度為31 ℃、34 ℃和37 ℃。

2.1.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵蘋果漿的影響

圖3 發(fā)酵時間對發(fā)酵蘋果漿活菌數、可滴定酸和感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation time on viable cell count,titratable acidity and sensory evaluation of fermented apple pulp

發(fā)酵時間影響乳酸的產量和口感，如圖3所示，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵體系中的活菌數和感官評分呈現先上升后下降的趨勢，可滴定酸表現為先增加后趨于平緩。在發(fā)酵第72小時，發(fā)酵體系中活菌數達到最大值8.53lg（CFU/mL），此時感官評分也達到最大值33.01，可滴定酸含量隨著發(fā)酵時間的延長而不斷累積增加，但是過量的酸積累會引起過酸的口感。因此，選擇發(fā)酵時間為60 h、72 h和84 h。

2.2 蘋果漿發(fā)酵工藝優(yōu)化BBD響應面試驗結果

依據單因素試驗結果，選擇接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）為自變量，活菌數（Y1）和感官評分（Y2）為響應值，運用Box-Behnken試驗設計優(yōu)化蘋果漿發(fā)酵工藝，結果見表3。

表3 蘋果漿發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface methodology for apple pulp fermentation conditions optimization

利用響應面軟件Design expert 8.0.6.1對表3試驗結果進行多元回歸擬合，獲得響應值活菌數（Y1）和感官評分（Y2）的回歸模型方程式分別為：

對這兩個模型進行回歸與方差分析，結果見表4和表5。

表4 以活菌數為評價指標的回歸模型方差分析結果Table 4 Variance analysis results of regression model using viable cell count as evaluation index

表5 以感官評分為評價指標的回歸模型方差分析結果Table 5 Variance analysis results of regression model using sensory evaluation as evaluation index

由表4可知，模型顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型復相關系數R2為0.9894，校正決定系數R2為0.9758，說明該模型擬合度較高。各因素對發(fā)酵蘋果漿中活菌數的影響程度從強到弱依次為：接種量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度，且結合表中F值可知，接種量（A）、發(fā)酵時間（C）、接種量和發(fā)酵溫度的交互項（AB）、接種量的二次項（A2）、發(fā)酵溫度的二次項（B2）和發(fā)酵時間的二次項（C2）為極顯著影響因素（P＜0.01），發(fā)酵溫度（B）為顯著影響因素（P＜0.05），其他因素影響較小。

由表5可知，模型顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型復相關系數R2為0.989 0，校正決定系數R2為0.974 7，說明模型擬合度較高。由P值可知，各因素對發(fā)酵蘋果漿感官評分的影響程度從強到弱依次為：發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時間，且結合表中F值可知，接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量和發(fā)酵時間的交互項（AC）、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的交互項（BC）、接種量的二次項（A2）、發(fā)酵溫度的二次項（B2）和發(fā)酵時間的二次項（C2）為極顯著影響因素（P＜0.01），其他因素影響較小。

根據回歸方程作各因素對活菌數及感官評分影響的響應面圖，結果見圖4。

圖4 接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度交互作用對活菌數及感官評分影響的響應面及等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum,fermentation temperature and time on viable cell count and sensory evaluation

由圖4可知，接種量和發(fā)酵溫度對活菌數含量的交互效應極顯著（P＜0.01）。隨著發(fā)酵時間的延長，蘋果漿中活菌數呈現先增長后逐漸減少的趨勢，在接種量為9%～10%，發(fā)酵時間為66～72 h時，活菌數較大；接種量和發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對感官評分的交互影響效應極顯著（P＜0.01）。

經過Design-Expert8.0.6.1軟件優(yōu)化處理后，以活菌數為主要評價指標，得到乳酸菌發(fā)酵蘋果漿的最佳工藝條件為：接種量10.08%（V/V），發(fā)酵溫度34.43 ℃，發(fā)酵時間70.6 h；以感官評分為主要評價指標，得到乳酸菌發(fā)酵蘋果漿的最佳工藝條件為：接種量9.79%（V/V），發(fā)酵溫度34.75 ℃，發(fā)酵時間70.98 h。為保證益生菌發(fā)酵蘋果漿最佳活菌數，同時參考感官評分評價指標，將該方案優(yōu)化修約后，得到乳酸菌發(fā)酵最佳工藝條件為：接種量10%（V/V），發(fā)酵溫度34 ℃，發(fā)酵時間71 h，通過三組平行試驗得到發(fā)酵蘋果漿的活菌數為9.01 lg（CFU/mL），感官評分33.91，與模型預測值較為吻合。

2.3 發(fā)酵蘋果漿的抗氧化能力

表6 發(fā)酵前后蘋果漿的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of apple pulp before and after the fermentation

由表6可知，與未經發(fā)酵的蘋果漿相比，發(fā)酵后的蘋果漿FRAP鐵離子還原能力、ABTS自由基清除能力顯著提高（P＜0.05）。葉盼等[20]利用植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁，發(fā)酵后的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和ABTS自由基清除能力顯著增強，發(fā)酵后的蘋果汁抗氧化性能得到提高。這可能是因為乳酸菌在發(fā)酵過程中產生了水解酶，使部分結合態(tài)多酚水解成游離酚，并且高酸環(huán)境阻止了酚類物質的降解，從而提高了發(fā)酵后果汁的抗氧化活性。

3 結論

本研究以蘋果漿為原料，結合乳酸菌發(fā)酵蘋果漿，在單因素試驗的基礎上，以活菌數和感官評分為響應值優(yōu)化蘋果漿發(fā)酵工藝參數。確定乳酸菌發(fā)酵蘋果漿最佳工藝條件為：接種量10%，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時間71 h。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵蘋果漿的活菌數實際值為9.01 lg（CFU/mL），感官評分實際值為34分。與未經發(fā)酵的蘋果漿相比，發(fā)酵后的蘋果漿FRAP鐵離子還原能力、ABTS自由基清除能力分別提高了5.78%和18.41%，說明乳酸菌發(fā)酵蘋果漿可有效提高產品的抗氧化活性。該研究為開發(fā)一種綠色營養(yǎng)、益生健康的發(fā)酵蘋果漿提供理論依據。