魚腐乳發(fā)酵過程中游離氨基酸含量及抗氧化活性的變化

周常義 ，沈會玲，江 鋒，江曉穎，林偉言，彭愛紅，劉 玉，蘇國成

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建廈門 361021；2.廈門中集信檢測技術(shù)有限公司，福建廈門 361021）

發(fā)酵食品是人類長期歷史進程中，在一定自然環(huán)境條件下形成的具有獨特風味、豐富營養(yǎng)和良好保藏性的食品。通過發(fā)酵不僅可以改變食品的風味，還可以提高營養(yǎng)價值，延長保藏期。世界各地的傳統(tǒng)發(fā)酵制品分布廣泛，許多國家都具有各具特色的發(fā)酵制品，如中國的腐乳、醬油、魚露等，日本的納豆，韓國的泡菜以及歐美的干酪、酸奶等[1]。趙培城等[2]采用紹興腐乳毛霉對低值海產(chǎn)魚糜固態(tài)發(fā)酵，制成與豆腐乳形態(tài)相似口感細膩的魚糜腐乳；周緒霞等[3]對魚糜接種真菌進行固態(tài)發(fā)酵；LADISLAUS K[4]使用豆豉發(fā)酵劑發(fā)酵魚醬，發(fā)現(xiàn)魚醬的營養(yǎng)價值和生物活性都有顯著提高；ANUPAM G等[5]利用曲霉發(fā)酵魚糜制作魚醬，并對魚醬發(fā)酵過程中抗氧化性、還原性的變化規(guī)律以及蛋白降解的規(guī)律進行研究，發(fā)現(xiàn)在魚醬制作的過程中抗氧化性和還原性呈逐漸升高的趨勢，且大分子蛋白逐漸降解為小分子。目前世界各國的魚業(yè)生產(chǎn)都存在著經(jīng)濟魚類逐年減少，低值小雜魚產(chǎn)量逐年增多的問題，因此如何加工利用低值小雜魚開發(fā)新蛋白產(chǎn)品，已引起世界各國的重視。

本研究以魚糜制品為研究對象，借鑒傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵工藝和原理，采用混合菌發(fā)酵魚腐乳，前期使用毛霉發(fā)酵，后期采用紅曲鹵汁發(fā)酵制作魚腐乳，研究魚腐乳在發(fā)酵的過程中游離氨基酸（free amino acid，F(xiàn)AA）及抗氧化活性的變化規(guī)律，旨在為開發(fā)魚腐乳產(chǎn)品優(yōu)化風味及穩(wěn)定產(chǎn)品品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FA級冷凍魚糜：福建某水產(chǎn)開發(fā)有限公司；總狀毛霉（Mucor recemosus）：百惠生物科技有限公司；紅曲霉（Monascus）F1：本實驗室保存菌株。

17種氨基酸標準品（分析純）：美國Sigma公司；水楊酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸、氫氧化鈉、過氧化氫、鄰苯二甲醛、芴甲氧羰酰氯、乙腈（分析純）：國藥集團化學有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：北京索萊寶公司；食鹽、淀粉、高粱酒均為食品級：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent100高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；3-30 K冷凍離心機：德國SIGMA公司；FD-1-50真空冷凍干燥器：北京博醫(yī)康儀器公司；UV-2000紫外分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京國華科技集團有限公司；PHX150生化培養(yǎng)箱：寧波萊?？萍加邢薰?。

1.3 實驗方法

1.3.1 魚腐乳的制作工藝及操作要點[6]

冷凍魚糜在4 ℃冰箱解凍后，空擂5 min，加入魚漿質(zhì)量3%的NaCl后再鹽擂10 min，加入淀粉，繼續(xù)擂潰10 min，加熱成型，冷卻后接種毛霉菌，27 ℃前發(fā)酵培養(yǎng)4 d，得到毛坯；撮毛后表面包裹10%食鹽，腌制1 d后置于經(jīng)過消毒的玻璃瓶內(nèi)，將制備好的紅曲鹵，兌入玻璃瓶內(nèi)，密封，后期發(fā)酵。

分別取前發(fā)酵期第0天、第2天、第4天，咸坯，后發(fā)酵期第7天、第14天、第21天、第28天的樣品進行測定。

1.3.2 游離氨基酸的測定

樣品前處理：稱取0.5 g樣品，加0.01 mol/L鹽酸，均質(zhì)1 min，靜置提取30 min，離心，取上清液定容至5 mL，過0.2 μm水系濾膜，上機分析。

檢測條件：參考張洵[7]的方法，采用在線柱前衍生（安捷倫公司自動在線衍生化方法），一級氨基酸與鄰苯二甲醛、二級氨基酸與芴甲氧羰酰氯衍生后過柱檢測。

色譜條件：色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）。流動相A：40 mmol/L磷酸二氫鈉（pH7.8）；流動相B：乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10（V/V）。

檢測信號：除脯氨酸使用熒光檢測外，其他氨基酸使用紫外檢測。紫外檢測波長為338 nm，熒光激發(fā)波長為266 nm，發(fā)射波長為305 nm。

1.3.3 游離氨基酸對魚腐乳滋味的貢獻評價方法

采用呈味強度值（taste active value，TAV）法評價單個游離氨基酸對魚腐乳滋味的貢獻，TAV表示各個呈味物質(zhì)的含量與其閾值的比值[8]。計算公式如下：

式中：C1為某氨基酸的質(zhì)量濃度；C2為相應氨基酸的閾值濃度。

1.3.4 抗氧化活性的測定

樣品前處理：參照ANUPAM G等[5]提取抗氧化活性物質(zhì)的方法，稱取5 g樣品。加入pH為7.2的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液25 mL，低溫勻漿5 min，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清，凍干備用。

DPPH自由基清除率的測定：將凍干樣品，稀釋成適當濃度，取1 mL待測樣品，加入1 mL 50 μmol/L DPPH乙醇溶液，充分混勻，室溫下避光反應30 min，于波長517 nm處測吸光度值，以1 mL乙醇代替樣品作空白。DPPH自由基清除率計算公式如下：

羥自由基清除率的測定：在比色管中一次加入9 mmol/L FeSO4，9 mmol/L乙醇-水楊酸，加入適量去離子水，最后加入8.8 mmol/L H2O2后搖勻，37 ℃水浴加熱，15 min后取出，測其吸光度值A(chǔ)0，其計算公式如下：

式中：A0為空白對照的吸光度值，AX為加樣品的吸光度值，AX0為不加顯色劑吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚腐乳發(fā)酵過程中游離氨基酸的變化

用高效液相色譜對魚腐乳發(fā)酵過程中各階段的游離氨基酸進行分析，魚腐乳發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化情況見表1。

表1 魚腐乳發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化Table 1 Changes of free amino acid contents during fish sufu fermentation

從表1可知，魚腐乳在發(fā)酵過程中共檢測出18種游離氨基酸，其中含有8種必需氨基酸，游離氨基酸和其含氮降解產(chǎn)物是發(fā)酵食品中重要的滋味物質(zhì)和風味前體物質(zhì)，是衡量發(fā)酵產(chǎn)品風味的一個重要指標[8]，發(fā)酵過程中總游離氨基酸的含量顯著升高，前期毛霉在生長代謝過程中產(chǎn)生的蛋白酶會分解蛋白質(zhì)為小肽或氨基酸，所以游離氨基酸的含量迅速升高，后期紅曲鹵的加入，帶入了部分游離氨基酸，而且后期發(fā)酵的過程中蛋白質(zhì)也會發(fā)生降解，所以游離氨基酸的含量繼續(xù)升高，但后期游離氨基酸的增長幅度較小，可能是因為后期鹽含量較高，抑制了蛋白酶的活性[9]，所以游離氨基酸的增長主要發(fā)生在前期發(fā)酵的過程中，后期成熟過程中游離氨基酸的含量增長緩慢。

發(fā)酵結(jié)束后總游離氨基酸的含量由52.56mg/100g增加至915.77 mg/100 g。其中8種必需氨基酸的含量由30.5 mg/100 g增加至491.68.70 mg/100 g，占總游離氨基酸的53.69%。谷氨酸和天冬氨酸是主要的鮮味物質(zhì)，鮮味氨基酸的含量在發(fā)酵28d時，增加至138.57 mg/100 g，占總游離氨基酸的15.13%，精氨酸、蛋氨酸等的苦味閾值較低[10]，適當?shù)目辔秾Ξa(chǎn)品的風味有利。另外，一些甜味氨基酸如甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸都有成倍的增加，產(chǎn)品會變得更加甘甜。

2.2 魚腐乳發(fā)酵過程中各類氨基酸的變化規(guī)律

根據(jù)氨基酸的味型與味覺強弱，大致可將氨基酸分為鮮味氨基酸（Asp、Glu、Lys）、甜味氨基酸（Thr、Ser、Gly、Ala、His、Pro）、苦味氨基酸（Val、Met、Ile、Leu、Arg）、芳香族氨基酸（Cys、Tyr、Phe）[10]。魚腐乳發(fā)酵過程中各類氨基酸含量的變化及各類氨基酸呈味強度值的變化見圖1及圖2。

圖1 魚腐乳發(fā)酵過程中各類氨基酸含量的變化Fig.1 Changes of various types of amino acid concentration during fish sufu fermentation

圖2 魚腐乳發(fā)酵過程中各類氨基酸呈味強度值的變化Fig.2 Changes of various types of amino acid taste active value (TAV)during fish sufu fermentation

從圖1、圖2可以看出，在魚腐乳發(fā)酵的過程中，鮮味氨基酸、必需氨基酸、疏水氨基酸、總氨基酸的含量都呈逐漸升高的趨勢，鮮味氨基酸在白坯（0 d）、毛坯（4 d）、咸坯、發(fā)酵最終產(chǎn)品（28 d）中的含量分別是3.6 mg/100 g、77.58 mg/100 g、104.31 mg/100 g、138.57 mg/100 g，含量明顯增加。8種必需氨基酸是人體所不能合成的氨基酸，對于人體的營養(yǎng)均衡有很重要的作用，在魚腐乳發(fā)酵的過程中，必需氨基酸在白坯、毛坯、咸坯、發(fā)酵最終產(chǎn)品中的含量分別是30.60 mg/100 g、219.90 mg/100 g、266.55 mg/100 g、491.68 mg/100 g，最終發(fā)酵魚腐乳的必需氨基酸含量較高。疏水氨基酸是側(cè)鏈具有較高疏水性的一類氨基酸，具有疏水作用，對于保持蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)以及維持生物膜結(jié)構(gòu)等方面具有重要的作用。在魚腐乳發(fā)酵的過程中，疏水氨基酸在白坯、毛坯、咸坯、發(fā)酵產(chǎn)品中的含量分別是25.92mg/100g、343.84 mg/100 g、350.22 mg/100 g、340.06 mg/100 g，在前期發(fā)酵的過程中疏水氨基酸增長較快，在毛坯、咸坯以及最終產(chǎn)品中變化不是很明顯?？傆坞x氨基酸的含量在白坯、毛坯、咸坯和產(chǎn)品中的含量分別是52.56 mg/100 g、529.24 mg/100 g、656.46 mg/100 g、915.77 mg/100 g，總游離氨基酸的含量呈持續(xù)快速增長的趨勢。研究還表明，發(fā)酵過程有助于鮮味物質(zhì)增加，其中Asp、Glu和Lys三種鮮味氨基酸的呈味活性值提高顯著，在發(fā)酵開始時分別為0.45、0.45、0.16，發(fā)酵第28天分別為19.62、16.03、4.78。此外，精氨酸的呈味活性值也有較大幅度變化。

LIN X等[12]從嗜熱真菌和嗜溫真菌中提取熱穩(wěn)定性好的亮氨酸氨基肽酶，酶活力為2 771.5 U/mL，將其應用于大豆蛋白水解，可以顯著提高水解度，去掉N端的疏水氨基酸，降低苦味。XU Y W等[13]利用片球菌發(fā)酵魚肉香腸，在發(fā)酵過程中游離氨基酸和非蛋白氮含量逐漸增加。王蔚新[14]在研究酸魚發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)降解及其風味形成中發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)酵后主要游離氨基酸為Glu、His、Lys、Ala、Leu和Asp等，其中Asp和Glu兩種鮮味氨基酸的呈味活性值最高。在火腿的研究中[15-16]，發(fā)現(xiàn)游離氨基酸對火腿滋味貢獻大，而且不同的存儲條件影響火腿滋味。由此可見，發(fā)酵產(chǎn)品的滋味與所用原料、菌種、發(fā)酵工藝、存儲條件等有一定關(guān)系。

2.3 魚腐乳發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化

魚腐乳發(fā)酵過程中的DPPH自由基清除率與羥基自由基測定結(jié)果見圖3。由圖3可知，在魚腐乳前期發(fā)酵的過程中，DPPH自由基清除率顯著升高，在魚腐乳后期成熟的過程中，DPPH自由基清除率呈緩慢升高的趨勢。DPPH自由基清除率被廣泛運用于測定產(chǎn)品抗氧化物質(zhì)的含量，包括自由基清除能力以及作為氫供體。很多研究表明肽類和蛋白質(zhì)水解物具有很強的抗氧化性，抗氧化肽作為一種潛在的抗氧化劑成為可能[17]。另外有一些關(guān)于魚醬的研究也發(fā)現(xiàn)，一些氨基酸比如賴氨酸、甘氨酸、纈氨酸也具有抗氧化活性[18-19]。在本研究中，魚腐乳整個發(fā)酵的過程中，賴氨酸、甘氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸以及酪氨酸都呈上升的趨勢。在發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率呈逐漸升高的趨勢，發(fā)酵第0天和第28天時DPPH自由基清除率分別為17.21%和70.30%。發(fā)酵過程中，抗氧化能力增強也有可能是因為蛋白質(zhì)在水解之后，部分具有抗氧化性的氨基酸殘基暴露。GUO H等[19]認為，兩肽或三肽比單個氨基酸抗氧化能力強，更易于吸收。關(guān)于魚腐乳發(fā)酵中的兩肽或三肽化合物變化情況有待進一步研究。

圖3 魚腐乳發(fā)酵過程中DPPH自由基和羥自由基清除率變化情況Fig.3 Changes of DPPH radical and hydroxyl radical scavenging rates during fish sufu fermentation

在所有的自由基中，羥自由基被認為是目前所知破壞力最強、毒性最大的一種自由基。直接或間接的引起脂質(zhì)氧化，蛋白質(zhì)變性、酶失活以及機體的病變或死亡，因此可以用羥自由基清除能力來衡量抗氧化活性[20]。從圖3可以看出，在前期發(fā)酵的過程中，羥自由基清除率呈較快速升高的趨勢，發(fā)酵第0天、第4天的羥自由基清除率分別為38.97%和49.21%。后期成熟的過程中，羥自由基清除率呈緩慢升高的趨勢，在第21天時為61.54%，第28天時達到63.11%。羥自由基清除率逐漸升高可能與發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)逐漸被水解，產(chǎn)生抗氧化肽及氨基酸有一定關(guān)系。

3 結(jié)論

本實驗利用毛霉和紅曲霉發(fā)酵制作魚腐乳，對魚腐乳發(fā)酵過程游離氨基酸及抗氧化活性的變化規(guī)律進行分析。在魚腐乳發(fā)酵過程中，鮮味氨基酸、必需氨基酸、疏水氨基酸、總氨基酸的含量都呈逐漸升高的趨勢。鮮味氨基酸的含量由3.6 mg/100 g上升至138.57 mg/100 g，必需氨基酸的含量由30.60 mg/100 g升高至491.68 mg/100 g，疏水氨基酸的含量由25.92 mg/100 g上升至340.06 mg/100 g，總游離氨基酸的含量由52.56 mg/100 g升高至915.77 mg/100 g。Asp、Glu和Lys這3種鮮味氨基酸呈味活性值升高顯著。魚腐乳在發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率和羥自由基清除率均呈逐漸升高的趨勢。綜上所述，魚腐乳發(fā)酵過程游離氨基酸總量、鮮味氨基酸及抗氧化活性均呈上升趨勢。