藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群變化觀察

趙金華，徐明，朱美君，孫曉娟

南通市第一人民醫(yī)院兒科，江蘇南通226001

癲癇是由不同病因引起的，腦部神經(jīng)元高度同步化的異常放電所致，是一種慢性的、反復(fù)出現(xiàn)的發(fā)作性疾病。癲癇為患兒最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，患病率在0.3%～0.9%［1］。大約三分之一的癲癇患兒最終發(fā)展為難治性癲癇［2］。盡管通過藥物、飲食、手術(shù)、迷走神經(jīng)刺激等方法，難治性癲癇仍然無法得到控制，而生酮飲食治療難治性癲癇已取得確切療效［3］。越來越多的研究表明，癲癇發(fā)病可能與腦腸軸失衡有關(guān)［4］。腸道微生物群通過腸—腦相互作用在廣泛的神經(jīng)障礙中發(fā)揮作用，但腸道菌群變化與難治性癲癇的關(guān)系目前少見報(bào)道。我們以健康患兒及藥物治療反應(yīng)性癲癇患兒作為對照，觀察了難治性癲癇患兒的腸道菌群變化，從而明確腸道菌群與難治性癲癇的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2019年9月-2020年6月在南通市第一人民醫(yī)院兒科就診的初診癲癇患兒50例（癲癇組），男35例、女15例，年齡1～10（4.97±2.30）歲。選同期在南通市第一人民醫(yī)院兒保門診體檢健康的患兒25例作為對照組，其中男17例、女8例，年齡1～10（4.64±2.23）歲。入組癲癇患兒及健康患兒均獲得監(jiān)護(hù)人的知情同意。入組癲癇患兒根據(jù)癲癇藥物治療原則［5-6］進(jìn)行抗癲癇治療。根據(jù)抗癲癇治療效果將患者分為藥物難治組（抗癲癇治療6個(gè)月癲癇發(fā)作減少≤50%）19例和藥物反應(yīng)組（癲癇發(fā)作減少＞50%）31例。藥物難治組使用抗癲癇藥物有丙戊酸鈉（VPA）16例；奧卡西平（OXC）11例；左乙拉西坦（LEV）7例；托吡酯（TPM）5例；拉莫三嗪（LTG）4例；氯硝西泮（CZP）2例；氨己烯酸（VGB）1例。藥物反應(yīng)組使用抗癲癇藥物有VPA 20例；OXC 11例；LEV 6例；TPM 3例。

1.2 腸道菌群的分析采用高通量測序分析方法。收集癲癇組患兒治療前、治療6個(gè)月后及對照組患兒的糞便標(biāo)本，取糞便的中段樣本，每份標(biāo)本重量應(yīng)大于5g，標(biāo)本采集后立即冷凍，運(yùn)送到高通量測序服務(wù)公司（南京金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司）。對糞便樣本提取細(xì)菌總DNA，隨后進(jìn)行16 S靶向擴(kuò)增、物種注釋及豐度分析，并與現(xiàn)有的健康腸道菌群數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到所有樣本的菌群數(shù)據(jù)譜。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析、進(jìn)一步組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物反應(yīng)組、藥物難治組、對照組腸道菌群多樣性分析結(jié)果癲癇組、對照組腸道菌群多樣性分別為3.41±0.28、3.25±0.26，兩組比較，t=2.408，P＜0.05。藥物難治組、藥物反應(yīng)組腸道菌群多樣性分 別 為3.55±0.24、3.33±0.27，兩 組比 較，t=2.987，P＜0.05。

2.2 藥物反應(yīng)組、藥物難治組、對照組門水平優(yōu)勢菌及差異組成分析結(jié)果藥物難治組治療前檢出擬桿菌門及厚壁菌門分別為4、10例，F(xiàn)/B 2.50；治療后檢出B、F分別為8、7例，F(xiàn)/B 0.87。藥物反應(yīng)組治療前檢出B、F分別為15、11例，F(xiàn)/B 0.73；治療后檢出B、F分別為17、8例，F(xiàn)/B 0.47。對照組檢出B、F分別為26、12例，F(xiàn)/B 0.46。門水平的優(yōu)勢菌群組成中，差B及F對照組、藥物反應(yīng)組治療前后的優(yōu)勢菌群均為擬桿菌門；藥物難治組治療前的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門，治療后優(yōu)勢菌群為厚壁菌門和擬桿菌門。藥物難治組治療前的F/B值高于藥物反應(yīng)組和對照組（P＜0.05）。

2.3 藥物反應(yīng)組、藥物難治組、對照組屬水平優(yōu)勢菌及差異組成分析結(jié)果藥物難治組治療前前10位優(yōu)勢菌屬分別為：梭菌屬（Clostridium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、克羅諾桿菌（Cronobacter）、多枝梭菌（Erysipelatoclostridium）、瘤胃球菌屬（Ruminococ?cus）、普氏菌屬（Prevotella）、糞桿菌屬（Faecalibacte?rium）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、勞特菌屬（Blautia）、阿克曼菌（Akkermansia），占比分別為30.56 %、15.16%、9.56%、7.73%、5.13%、4.92%、4.83%、4.78%、1.32%、0.78%；治療后前10位優(yōu)勢菌屬菌群分別為擬桿菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬、糞桿菌屬、阿克曼菌、普氏菌屬、瘤胃球菌屬、克羅諾桿菌、狄氏副擬桿菌（Parabacteroides）、多枝梭菌，占比分別為34.12%、12.16%、9.97%、9.02%、6.92%、6.59%、4.71%、4.70%、1.42%、0.85%。藥物反應(yīng)組治療前前10位優(yōu)勢菌屬菌群分別為擬桿菌屬、瘤胃球菌屬、梭菌屬、普氏菌屬、雙歧桿菌屬、多枝梭菌、勞特氏菌屬、糞桿菌屬、克羅諾桿菌、狄氏副擬桿菌，占比分別為38.35%、11.28%、8.12%、7.72%、7.18%、4.78%、4.57%、3.28%、2.83%、1.02%；治療后前10位優(yōu)勢菌屬菌群分別為擬桿菌屬、普氏菌屬、瘤胃球菌屬、雙歧桿菌屬、糞桿菌屬、梭菌屬、克羅諾桿菌、阿克曼菌、考拉桿菌屬（Phascolarctobacte?rium）、勞特氏菌屬，占比分別為40.89%、11.67%、10.82%、8.34%、5.48%、3.02%、2.91%、2.19%、1.42%、0.98%。對照組菌群前10位優(yōu)勢菌屬分別為擬桿菌屬、糞桿菌屬、雙歧桿菌屬、普氏菌屬、克羅諾桿菌、瘤胃球菌屬、勞特菌屬、羅斯菌屬（Rose?buria）、狄氏副擬桿菌、梭菌屬，占比分別為39.32%、12.38%、12.21%、7.15%、6.17%、3.12%、2.62%、1.76%、1.38%、1.15%。

藥物反應(yīng)組治療前后優(yōu)勢菌群差異不大，優(yōu)勢菌群為擬桿菌屬、瘤胃球菌屬和普氏菌屬（t=1.502、P＞0.05；t=1.383，P＞0.05、t=6.751，P＜0.05）。藥物難治組治療前后優(yōu)勢菌群差異較大，治療后豐度增加的菌屬有擬桿菌屬、雙歧桿菌屬及阿克曼菌（t分別為58.587、8.179、16.463，P均＜0.05），減少的有梭菌屬、克羅諾桿菌及多枝梭菌（t分別為22.635、10.999、21.827，P均＜0.05）。

治療前，與對照組、藥物反應(yīng)組比較，藥物難治組豐度多的菌屬有梭菌屬（F=1359.239，P＜0.05；兩兩組間比較，t分別為52.08、36.76、14.55，P均＜0.05）和克羅諾桿菌（F=118.411，P＜0.05；兩兩組間比較，t分別為8.26、15.17、9.60，P均＜0.05），豐度少的菌屬有擬桿菌屬（F=479.032，P＜0.05；兩兩組間比較，t分別為29.70、26.37、1.41，藥物反應(yīng)組與對照組間比較，P＞0.05，余兩兩組間比較，P均＜0.05）和雙歧桿菌屬（F=99.262，P＜0.05；兩兩組間比較，t分別為12.64、3.79、10.09，P均＜0.05）。治療后，與對照組、藥物反應(yīng)組比較，藥物難治組治療前原有豐度多的菌屬如梭菌屬仍有差異（F=579.246，P＜0.05；兩兩組間比較，t分別為33.74、25.91、6.76，P均＜0.05），原有豐度少的菌屬如擬桿菌屬（F=12.723，P＜0.05；兩兩組間比較，t分別為4.53、5.45、1.61，藥物反應(yīng)組與對照組間比較，P＞0.05，余兩組間比較，P均＜0.05）和雙歧桿菌屬（F=27.557，P＜0.05；兩兩 組間 比較，t分別 為3.61、2.43、7.35，P均＜0.05）亦仍有差異。

3 討論

腸道菌群作為一大類微生物群主要定植于人體消化道中，數(shù)目多、類別豐富，與宿主的免疫系統(tǒng)發(fā)生一系列動(dòng)態(tài)相互作用，有助于維持代謝動(dòng)態(tài)平衡，維生素B的合成，改善消化，促進(jìn)血管生成和神經(jīng)功能［7-8］。人體腸道定植約104數(shù)量級的細(xì)菌叢，其細(xì)胞總數(shù)大約是人體自身細(xì)胞的10倍，根據(jù)細(xì)菌16 S rRNA序列分類，腸道細(xì)菌有500～1 000種，主要由厚壁菌門（如Ruminococcus，Clostridium，Eubacte?ria）、擬桿菌門（如Porphyromonas，Prevotella）、放線菌門（如Bifidobacterium）等組成［8-9］。本研究亦證實(shí)不管是正常健康患兒還是癲癇患兒，其腸道菌群均主要由厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門等組成，只不過優(yōu)勢菌群各有不同。

“腸腦軸”是指胃腸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的雙向相互作用。較多研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)疾病與腦腸軸失衡有關(guān)［4］，大腦可能通過免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控胃腸道功能，而腸道菌群可能通過迷走神經(jīng)、神經(jīng)遞質(zhì)（如5-羥色胺、多巴胺）、神經(jīng)營養(yǎng)因子（如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子）等影響大腦功能。既往研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群和大腦之間有五種可能的交流途徑，其中包括神經(jīng)連接、下丘腦—垂體—腎上腺軸、腸道細(xì)菌合成的神經(jīng)遞質(zhì)、腸道免疫系統(tǒng)以及腸黏膜屏障與血腦屏障之間的相互連接［10］。藥物難治性癲癇患者約占全球癲癇患者總數(shù)的三分之一，其耐藥性的病理生理機(jī)制尚未完全闡明；然而，目前的證據(jù)表明，腸道生態(tài)失調(diào)可能是致病因素之一［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康患兒及藥物反應(yīng)性癲癇患兒相比，藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群多樣性顯著增高，稀有微生物群的豐度增加，與PENG等［12］研究結(jié)果一致。但XIE等［13］研究發(fā)現(xiàn)藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群多樣性是下降的；LINDEFELDT等［14］研究顯示藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群多樣性沒有顯著差異，與本研究結(jié)果不一致。筆者分析三個(gè)研究結(jié)果不一致的原因考慮與研究對象年齡差異有關(guān)，因?yàn)槟c道微生物組成在很大程度上顯示出年齡依賴性［10］，故藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群的多樣性變化尚需進(jìn)行大樣本的研究。既往多數(shù)研究［12-14］均提示藥物難治性癲癇患兒的厚壁菌門增多，擬桿菌門下降，F(xiàn)/B顯著升高。本研究結(jié)果顯示，與健康患兒及藥物反應(yīng)性癲癇患兒相比，藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群F/B升高，與文獻(xiàn)報(bào)道相似。F/B是衡量整個(gè)腸道微生物平衡的重要指標(biāo)，藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群F/B顯著升高提示其腸道微生物失衡。

藥物反應(yīng)組癲癇患兒抗癲癇治療前后腸道優(yōu)勢菌門差異不大，優(yōu)勢菌群以擬桿菌門為主，與健康患兒相仿。藥物難治組癲癇患兒抗癲癇治療前后腸道優(yōu)勢菌門差異較大，治療前以厚壁菌門占優(yōu)勢，治療后變?yōu)楹癖诰T與擬桿菌門均占優(yōu)勢。藥物難治組與對照組、藥物反應(yīng)組治療前腸道菌群的菌屬比較，豐度多的菌屬有梭菌屬和克羅諾桿菌，豐度少的菌屬有擬桿菌屬和雙歧桿菌屬。梭菌屬能夠通過發(fā)酵糖和蛋白產(chǎn)生有機(jī)酸和醇類，屬內(nèi)多個(gè)菌種可以產(chǎn)生毒素，含量過高可引發(fā)炎癥，而炎癥參與癲癇發(fā)展，炎癥和癲癇之間的因果關(guān)系是相互的［15-18］。雙歧桿菌豐度減少的一個(gè)結(jié)果可能是短鏈脂肪酸的產(chǎn)生減少，特別是乙酸鹽和丁酸鹽。丁酸鹽能保護(hù)原代神經(jīng)元和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞免受氧化損傷。乙酸和丁酸是短鏈脂肪酸的組成部分，短鏈脂肪酸是腸道陰離子的主要存在形式，能被腸上皮細(xì)胞迅速吸收。短鏈脂肪酸對哺乳動(dòng)物產(chǎn)生多種有益作用，如免疫調(diào)節(jié)和能量消耗，短鏈脂肪酸也可能有助于調(diào)節(jié)大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和功能。由于短鏈脂肪酸的神經(jīng)活性及其對其他腸腦信號通路的影響，短鏈脂肪酸可能直接或間接地通過微生物群—腸—腦軸參與交流。LEE等［19］發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌群可作為癲癇相關(guān)腸道微生物組的潛在生物標(biāo)志物之一。因此，雙歧桿菌屬可能可作為判斷癲癇治療效果的潛在生物標(biāo)志物，其減少不利于癲癇的治療，提示在抗癲癇的治療中補(bǔ)充雙歧桿菌屬是有益的。

綜上所述，藥物難治性癲癇患兒存在腸道菌群失調(diào)，腸道菌群多樣性及稀有性細(xì)菌增多。腸道菌群與癲癇存在關(guān)聯(lián)，我們有可能通過改變腸道微生物群，從而治療癲癇［20］。由于藥物反應(yīng)性和難治性癲癇患者的腸道菌群組成存在顯著差異，腸道微生物的差異可能用以預(yù)測癲癇患者的預(yù)后和評估藥物治療反應(yīng)。但目前仍缺乏抗癲癇藥物與腸道微生物群直接相互作用的證據(jù)。一項(xiàng)體外研究顯示，拉莫三嗪可抑制大腸桿菌中核糖體的產(chǎn)生［21］，一項(xiàng)動(dòng)物研究表明，氯硝西平可被腸道菌群代謝［22］，未來需要對抗癲癇藥物與腸道微生物群相互作用的影響進(jìn)行更深入的研究。