磺胺類藥物殘留危害及其檢測方法的研究進展

王炫凱，曲寶成*，艾孜買提·阿合麥提，周 霈，李美杰

（1.大連海洋大學海洋科技與環(huán)境學院，設(shè)施漁業(yè)教育部重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.漢口學院管理學院，湖北 武漢 430212；3.漢口學院計算機學院，湖北 武漢 430212）

1 磺胺類藥物的環(huán)境殘留現(xiàn)狀

磺胺類藥物是畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域使用最多的藥物之一，國內(nèi)外已有很多關(guān)于其殘留所導致的環(huán)境安全問題的報道。相關(guān)研究表明，環(huán)境中獸藥種類與濃度的逐年增加就是由大量獸藥的使用所引起的［1］。

1.1 地表水 地表水包括地球表面的河流、湖泊、冰川、沼澤等。Luo［2］研究發(fā)現(xiàn)海河主干及支流中每升水的磺胺類抗生素的濃度范圍介于24～385 ng，頻率范圍介于76%～100%。

1.2 地下水 在地下20 m 左右的地下水中也檢測到磺胺類藥物的存在，這些地區(qū)的養(yǎng)殖業(yè)、種植業(yè)通常比較發(fā)達［3］。

1.3 養(yǎng)殖水體 我國養(yǎng)殖業(yè)比較發(fā)達，但抗生素殘留問題也十分嚴重。阮悅斐等［4］對天津近郊地區(qū)的淡水養(yǎng)殖水體調(diào)查后發(fā)現(xiàn)磺胺甲噻二唑、磺胺二甲氧嘧啶等磺胺類抗生素主要分布在沉積物中，每升水中污染物的濃度范圍介于1.5～30.1 μg。

1.4 污水處理廠 由于處理抗生素污水難度高、成本大、技術(shù)復雜，目前的污水廠不能夠有效地去除污水中的抗生素。西班牙污水處理廠就曾檢測到每升水中磺胺嘧啶的濃度在30 ng 以上。

1.5 水體沉積物 攜帶有抗生素的污水經(jīng)過污水處理廠的處理，最后會進入到水底淤泥沉積物中。連璐璐［5］對濱海養(yǎng)殖水體檢測發(fā)現(xiàn)不同生物養(yǎng)殖池沉積物中，其抗生素殘留濃度不同，蝦養(yǎng)殖池沉積物中的抗生素總濃度明顯低于海參養(yǎng)殖池。

1.6 土壤 根據(jù)國外相關(guān)報道，每年進入每公頃農(nóng)田土壤的磺胺類抗生素少則幾十克，多則幾百克。李彥文等［6］對廣東省菜地土壤中的6種磺胺類抗生素進行調(diào)查，得出磺胺類單個化合物的平均檢出率在60%左右。

1.7 動物糞便 磺胺類藥物在養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)上的廣泛使用，造成很大一部分隨動物糞便流入到環(huán)境當中，增加生態(tài)風險。Martinez等［7］在雞糞中就檢測出了大量的磺胺嘧啶。

2 磺胺類藥物殘留的不利影響

2.1 影響人類身體健康

2.1.1 人類病原性細菌的耐藥性上升 長期生長于低濃度抗菌藥環(huán)境中的細菌，其耐藥性會逐漸增強，打破了環(huán)境與人、動物之間的和諧關(guān)系［8］。耐藥菌株進入人體后導致免疫力下降，一些病原性細菌疾病將面臨無藥可醫(yī)的境況，使得臨床用藥壓力巨大［9］。

2.1.2 消化、泌尿、血液系統(tǒng)功能失調(diào) 磺胺類藥物進入胃腸道以后，破壞原有的菌群結(jié)構(gòu)，使人出現(xiàn)惡心、腹瀉等癥狀，進而出現(xiàn)并發(fā)性神經(jīng)炎癥狀?；前奉愃幬镌诟闻K中經(jīng)過乙酰化會變成不易溶解的乙?；前范Y(jié)成晶體，阻塞腎小管，出現(xiàn)尿急、尿痛等現(xiàn)象。磺胺類藥物還會使血液中粒細胞減少，導致再生障礙性貧血、溶血性貧血等不良反應(yīng)。

2.1.3 出現(xiàn)過敏、變態(tài)反應(yīng)和三致現(xiàn)象 食用了磺胺類藥物超標的食品后會出現(xiàn)過敏或休克，損害造血機能，加重心律失常病人的病情，出現(xiàn)四肢乏力、顫抖等中毒現(xiàn)象。經(jīng)常使用磺胺類藥物會引起嚙齒類動物甲狀腺增生或?qū)е履[瘤。通過肉、奶、蛋等食品途徑進入人體后，會影響骨髓造血功能、損害肝臟。

2.2 危及食品質(zhì)量安全 部分動物性食品行業(yè)不加節(jié)制地使用磺胺類抗生素，導致其在動物體內(nèi)不能夠完全分解，最終通過食物鏈流入餐桌，危及人類健康。

2.3 動物健康面臨威脅 多種抗生素濫用會造成動物體內(nèi)細菌的耐藥性增強，增大患病的可能性。同時，細菌耐藥性的增強勢必會給疫苗接種造成困難，加大動物疫病的防控難度，增加動物死亡風險，減少養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)效益。曾有人對養(yǎng)殖場的動物、工作人員所攜帶的細菌進行耐藥性分析，結(jié)果表明動物體內(nèi)的大腸桿菌很多都具有耐藥性，與用藥量的大小和次數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系［10］。

2.4 阻礙出口貿(mào)易發(fā)展 我國作為WTO 的一員，必須恪守國際公約，實施嚴格的環(huán)境標準，但綠色貿(mào)易壁壘使我國農(nóng)產(chǎn)品出口面臨多重困難［11］。根據(jù)相關(guān)報道，近二十年來的國際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中，我國一直處于逆差狀態(tài)。磺胺類抗生素殘留制約著農(nóng)產(chǎn)品出口貿(mào)易的發(fā)展，如此一來發(fā)達國家會以保護生態(tài)環(huán)境和保障食品安全為由拒絕我國農(nóng)產(chǎn)品進入其國內(nèi)，加大我國農(nóng)產(chǎn)品出口的難度［12］。

2.5 造成環(huán)境污染 動物體內(nèi)殘留的磺胺類抗生素可能會伴隨動物糞便、尿液進入環(huán)境之中。減少土壤真菌數(shù)量，改變微生物群落結(jié)構(gòu)，降低土壤肥力。進入水體會危及水生動物，破壞生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性，影響水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

3 磺胺類藥物殘留的檢測方法

國內(nèi)外目前已有30 種左右的方法來檢測磺胺類藥物，下面將對常用的幾種檢測方法進行介紹，并對目前較為成熟的高效液相色譜法作重點論述。

3.1 高效液相色譜法

3.1.1 概述 高效液相色譜法采用高壓輸液系統(tǒng)把緩沖液、不同比例的混合試劑或不同極性的單一試劑等液體流動相泵入裝有特制固定相的色譜柱內(nèi)，待各成分在柱內(nèi)被分離后，再進入檢測器進行分析檢測，檢測器通常包括紫外-可見光檢測器、二極管陣列檢測器以及熒光檢測器等［13］。主要使用C8、C18 色譜柱，流動相一般為乙腈-甲酸、乙腈-磷酸、乙腈-乙酸和甲醇-乙酸等。

該方法由于前處理時間較長、分析速度慢，對于抗生素殘留的快速檢測不太適用，大都用于確證分析，而且必須有已知標準作為參照才能對未知物質(zhì)進行定性，不能直接對未知物質(zhì)進行定性，當缺少可供參考的已知標準時，就需要紅外法、質(zhì)譜法的協(xié)助。高效液相色譜法的檢測設(shè)備體積大且十分復雜，維護修理費用高，需要大量的流動相有機試劑作為支持，容易造成試劑浪費及環(huán)境破壞，大規(guī)模檢測時不太實用［14］。此外，它還具有明顯的“柱外效應(yīng)”。

3.1.2 樣品處理 如果樣品是藥片、藥水，可將其碾成粉狀，用稀氫氧化鈉溶液溶解；對于藥水，稀釋后再檢測；如果是生物、食品、飼料樣品，可以用甲醇、三氯乙酸把樣品的蛋白質(zhì)去除后再進行檢測，但只有在樣品藥物濃度較高的情況下才適用，且易受雜質(zhì)干擾。

一般使用液相萃取來進行樣品處理，用乙酸乙酯、氯仿、70%乙腈作為萃取液，把樣品和萃取液混合，通過pH 調(diào)節(jié)、組分萃取液的回洗、附加的pH調(diào)節(jié)或再次溶劑分配等來實現(xiàn)萃取。共萃物質(zhì)限制了檢測方法的多樣性，使分析較為煩瑣，影響檢測進度，降低分析的準確度。

現(xiàn)在，固相萃取也成為一種常見的樣品處理方式，陽離子交換樹脂、中性氧化鋁等都是常用固相。固相萃取前，要對樣品進行稀釋，當磺胺類藥物吸附在固相上，雜質(zhì)流出柱外時，可以用溶劑去除雜質(zhì)，再用甲醇-三乙胺等淋洗磺胺類藥物。對于固態(tài)樣品，要將其抽取至溶液中，再用處理液體樣品的方法進行固相萃取，回收率不高，但可避免共萃物質(zhì)的干擾。

另外一種樣品處理方法——基質(zhì)固相分散（MSPD），現(xiàn)已被應(yīng)用于處理含磺胺類抗生素，它在處理幼兒奶制品、豬肉組織等方面取得了良好效果。該方法對溶劑的消耗量小且樣品回收率高。先將樣品和反相色譜柱填料混合，用己烷沖洗色譜柱去除類脂化合物，再用二氯甲烷洗脫被吸附的組分，而高極性雜質(zhì)還留在柱內(nèi)。

3.1.3 樣品分離 通過高效液相色譜法對磺胺類藥物進行分離時，一般采用短鏈烷基反相系統(tǒng)、長鏈烷基反相系統(tǒng)，反相色譜柱使用較多，短鏈烷基鍵合相只對極性樣品分子適用，但長鏈烷基鍵合相對很多樣品分子都有較好的適應(yīng)能力，尤其是對多組分磺胺類藥物的分離，反相色譜柱的優(yōu)勢更加明顯。

有研究者利用動力學改性硅膠分離磺胺類藥物，已被應(yīng)用于柳氮磺胺吡啶代謝物的臨床檢驗和復合劑量研究中。用裸露的硅膠裝柱，將嗅化十六烷基三甲基胺加入流動相，在流動相經(jīng)過色譜柱時，與硅膠形成反相系統(tǒng)。嗅化十六烷基三甲基胺陽離子與陰離子構(gòu)成離子對系統(tǒng)，通過反相過程或離子對反相過程實現(xiàn)組分分子分離。

此外，磺胺類藥物可通過在流動相里加入離子對試劑形成離子對系統(tǒng)來實現(xiàn)分離，因為磺胺是有機堿類藥物，利用1-正辛烷磺酸、1-辛烷磺酸鈉等烷基磺酸及其鹽作為離子對試劑。

3.1.4 樣品檢測 一般用紫外-可見光分光光度計、熒光光譜電化學法進行磺胺類藥物檢測。紫外檢測波長通常在226～360 nm 之間，主要采取柱后衍生方式，讓磺胺類藥物和4-二甲氨基苯甲醛產(chǎn)生反應(yīng)，檢測限能夠達到0.01 μg。紫外分光光度計對于同時分析多組分磺胺類藥物非常方便，但選擇性較差。

對于磺胺脒等具有天然熒光成分的一類磺胺類藥物，可用275～340 nm 波長直接進行熒光檢測，但其熒光本身不強，檢測靈敏性較差。可在磺胺類藥物中使用適量的熒光試劑，通過柱前、柱后衍生反應(yīng)，產(chǎn)生較多熒光物質(zhì)，使檢測限降低至0.015 ng。

電化學檢測主要依據(jù)電化學原理及樣品電化學性質(zhì)進行檢測，靈敏度高，選擇性好，檢測限達10 nmol［15］。

3.2 氣相色譜法 20 世紀50 年代初，James、Martin提出氣相色譜法，被廣泛用于藥物分析、環(huán)境監(jiān)測和食品檢測等領(lǐng)域，且在磺胺類抗生素殘留分析中的應(yīng)用也較為廣泛。按固定相不同，分為氣固色譜、氣液色譜兩大類，它是把氣體作為流動相，流經(jīng)裝有不同填充劑的色譜柱進行分離檢測。具備效率高、靈敏度強等優(yōu)點，成為我國進出口商品檢驗行業(yè)標準中檢測磺胺甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺間二甲氧嘧啶的方法［16］。樣品用乙腈提取濃縮，加入鹽酸溶液和乙醚-正己烷（1＋1）凈化，然后用乙酸乙酯反提取和重氮甲烷甲基化后檢測。該方法以電子捕獲檢測器為主要的檢測器，而該檢測器靈敏度很高，易受多種雜質(zhì)影響，所以對樣品前處理、凈化等環(huán)節(jié)要求很高。另外，重氮甲烷試劑容易發(fā)生爆炸，導致氣相色譜法的應(yīng)用不太普遍，隨著液相色譜法的不斷完善，它已逐漸沒落［17］。

3.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在液相色譜法基礎(chǔ)上建立起來，但其專屬性更強，靈敏度也更高。把液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)，樣品經(jīng)過液相色譜分離并離子化，質(zhì)譜的質(zhì)量分析器把離子化的碎片按質(zhì)荷比分開，通過檢測器分析得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用將色譜、質(zhì)譜優(yōu)勢結(jié)合，巧妙利用色譜對復雜樣品的分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度，提高對復雜樣品的分離效率。但由于設(shè)備價格昂貴、質(zhì)譜譜庫不完善、基質(zhì)效應(yīng)等問題制約了液質(zhì)聯(lián)用法的發(fā)展。

3.4 毛細管電泳法 當樣品量很小時，比較適合使用毛細管電泳法進行分析，可以發(fā)揮其定量分析的優(yōu)勢。該方法是根據(jù)樣品中各組分間的淌度和分配行為上的特點，將彈性石英毛細管作為分離通道，把高壓直流電場作為驅(qū)動力，對樣品物質(zhì)進行分離。與質(zhì)譜、電化學檢測器等高靈敏度檢測器聯(lián)用，不但提高了靈敏度，并且前處理程序簡單、分離效果好，可對多種物質(zhì)實現(xiàn)同步檢測。Mala 等［18］開發(fā)出了一種新的電噴霧電離結(jié)合質(zhì)譜法，并首次用于檢測水中磺胺類抗生素的殘留。在實際應(yīng)用中，因為其所需進樣量很少，就會降低精準度、靈敏度，造成分析偏差。為了解決這一問題，Ji 等［19］提出了新型毛細管電泳檢測器-鍍銀檢測窗口和毛細管柱內(nèi)光纖發(fā)光二極管誘導熒光檢測器，實驗證實有鍍銀檢測窗口的毛細管電泳檢測系統(tǒng)的檢出限明顯低于無鍍銀檢測窗口的毛細管電泳檢測系統(tǒng)，且日內(nèi)與日間遷移時間、相應(yīng)峰值面積的精度更高，回收率也較高，說明經(jīng)改進的毛細管電泳檢測系統(tǒng)靈敏度更強、重現(xiàn)性更好、準確度更高。

3.5 免疫分析法 免疫分析法將抗原與抗體的特異性以及可逆性結(jié)合反應(yīng)作為基礎(chǔ)，適合用于痕量分析，能進行規(guī)模化篩選，此方法的關(guān)鍵是制備針對磺胺類藥物的特異性抗體。主要有酶聯(lián)免疫分析法、放射免疫分析法等。該方法前處理過程簡單、操作簡便，常用于大批量磺胺類藥物的檢測。但在操作過程中穩(wěn)定性不高，易出現(xiàn)假陽性問題，不適用于確證性實驗。

4 總結(jié)與展望

對于磺胺類藥物的殘留檢測，目前國內(nèi)外分析技術(shù)并不成熟，儀器的靈敏度還需提高，分析方法也亟待完善。在分析過程中，如果能根據(jù)食品基質(zhì)的特點選擇合適的檢測方法將會事半功倍，當前研究的熱點主要是樣品提取與凈化環(huán)節(jié)的改善，因為它對分析結(jié)果的可靠性、準確性有著直接影響。檢測手段方面，主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法等，高效液相色譜法因為有著超強的分析能力，并且靈敏度高、檢出限低，已成為主流檢測方法，在許多抗生素殘留檢測方面都有所涉及。柱前衍生效應(yīng)的開發(fā)、固定相的研究以及對磺胺類抗生素全自動化分析的探索將助推高效液相色譜法更上一層樓。

在未來，開發(fā)出檢測效率高、檢出限低，同時又兼具檢測成本低、可靠性強、靈敏度高等優(yōu)點的檢測技術(shù)，是關(guān)乎生態(tài)文明、人類健康、食品安全、經(jīng)濟發(fā)展的長久大計。