酵母的大分子營養(yǎng)需求與轉(zhuǎn)運策略（Ⅱ）

俞麗燕，章亭洲

（浙江科峰生物技術(shù)有限公司固態(tài)發(fā)酵與生物飼料研究院，浙江 海寧 314423）

3 酵母營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運機制

營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運進入酵母細胞需要依次穿過細胞壁和細胞質(zhì)膜。酵母細胞壁并非營養(yǎng)物質(zhì)自由出入的結(jié)構(gòu)，通常分子量大于700 u的分子難以穿過細胞壁。酵母細胞質(zhì)膜作為營養(yǎng)物質(zhì)進出的選擇性屏障，決定哪些營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞以及哪些代謝物排出細胞。

3.1 營養(yǎng)物質(zhì)攝取的機制

（1）自由擴散。是脂溶性溶質(zhì)被動通過細胞質(zhì)膜的一種營養(yǎng)物質(zhì)運送方式，溶質(zhì)從濃度高的一側(cè)轉(zhuǎn)運至濃度低的一側(cè)，例如酵母對短鏈烷烴和長鏈脂肪酸的吸收，以及乙醇和氣體物質(zhì)的外排等。這種方式是酵母中最簡單且效率最低的物質(zhì)運送方式。

（2）促進擴散。是溶質(zhì)在轉(zhuǎn)運蛋白協(xié)助下進行被動擴散的營養(yǎng)物質(zhì)運送方式，如釀酒酵母對葡萄糖的吸收。由于轉(zhuǎn)運蛋白的參與，該方式比簡單擴散轉(zhuǎn)運速度快，常見的轉(zhuǎn)運蛋白包括通透酶（permease）、載體蛋白（carrier）和促進蛋白（facilitator），它們對轉(zhuǎn)運的溶質(zhì)表現(xiàn)出立體特異性。

（3）擴散通道。是某些離子通過電壓依賴性離子通道順濃度梯度轉(zhuǎn)運營養(yǎng)物質(zhì)的運送方式，如釀酒酵母對于K+的運送[15]。離子通道由蛋白質(zhì)組成，酵母細胞處于靜息狀態(tài)時離子通道關(guān)閉，而受刺激后離子通道打開。K+通道是酵母中最主要的離子通道，還存在一些其他的通道。

（4）主動運輸。是營養(yǎng)物質(zhì)逆濃度梯度通過細胞質(zhì)膜的一種營養(yǎng)物質(zhì)運送方式，其過程需要能量，如質(zhì)子動力勢等。主動運輸是酵母中最主要的物質(zhì)運送方式，不僅負責(zé)大多數(shù)營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，還負責(zé)很多代謝物的外排。

單純擴散是酵母細胞營養(yǎng)運輸最簡單、最慢的方式，脂溶性溶質(zhì)通過質(zhì)膜被動滲透。溶質(zhì)從細胞外高濃度擴散到細胞內(nèi)低濃度。被動擴散可能是酵母細胞吸收未解離有機酸、短鏈烷烴和長鏈脂肪酸以及輸出乙醇和氣態(tài)化合物的原因。在酵母細胞膜上產(chǎn)生適當(dāng)電勢差驅(qū)動力時，帶電的溶質(zhì)會積累。

促進擴散比單純擴散快，溶質(zhì)以酶介導(dǎo)的方式隨跨膜濃度梯度向下轉(zhuǎn)移。該酶稱為滲透酶或載體或促進劑，它穿過膜并對被運輸?shù)娜苜|(zhì)顯示立體特異性。與被動擴散一樣，營養(yǎng)物質(zhì)的運輸一直持續(xù)到細胞內(nèi)的濃度等于細胞外的濃度為止，對于底物濃度而言，吸收是飽和的。某些糖以此方式運輸?shù)郊毎?nèi)，尤其是釀酒酵母中的葡萄糖。

擴散通道某些離子在酵母細胞中作為電壓依賴的“門”存在，使離子沿濃度梯度移動。這種蛋白通道通常在靜息酵母細胞的膜電位為負時關(guān)閉，當(dāng)膜電位變?yōu)檎龝r打開。B.J.Reid等[16]在分子上表征了釀酒酵母中通過膜去極化激活的K+外排通道。質(zhì)膜K+通道是酵母中的主要離子通道，但線粒體和液泡膜等其他離子通道也存在于酵母細胞。例如，M.C.Gustin等[17]利用膜片鉗技術(shù)在酵母細胞膜上發(fā)現(xiàn)了一個機械敏感通道。這種通道為了維持細胞內(nèi)Ca2+平衡，引導(dǎo)陽離子和陰離子參與酵母細胞鹽脅迫反應(yīng)。質(zhì)膜的擴散孔在酵母細胞膜上也存在，允許水和糖醇通過。

主動轉(zhuǎn)運是一種基于化學(xué)滲透-能量依賴的運輸模式，負責(zé)將大部分營養(yǎng)物質(zhì)吸收到酵母細胞中。在主動轉(zhuǎn)運過程中，營養(yǎng)物對抗?jié)舛忍荻鹊闹饕騼?nèi)驅(qū)動力是質(zhì)膜H+-ATP酶產(chǎn)生的膜電位和跨膜電化學(xué)質(zhì)子梯度。后者利用ATP 水解的自由能擠壓質(zhì)子以控制細胞內(nèi)的pH 值，是酵母營養(yǎng)和生長中至關(guān)重要的一種酶。水解每個ATP 的質(zhì)子凈流出量不是一個固定參數(shù)，K.Venema 等[18]討論了釀酒酵母質(zhì)膜H+-ATP酶轉(zhuǎn)運偶聯(lián)的代謝調(diào)控。質(zhì)子原動力使?fàn)I養(yǎng)物既可以如同向運動機制中的質(zhì)子流進來，也可以如反運動機制中的質(zhì)子外流。對于許多酵母，質(zhì)子共生發(fā)生糖的集中攝取。值得注意的是，代謝物可以通過這種方式從酵母中排出。質(zhì)子原動力使?fàn)I養(yǎng)物隨同向運動的質(zhì)子流進來，也可以隨反向運動的質(zhì)子流出。對許多酵母來說，高濃度的糖吸收是通過質(zhì)子共聚發(fā)生的。酵母也可以通過主動轉(zhuǎn)運的方式排出代謝產(chǎn)物。

特定的滲透酶（組成型或誘導(dǎo)型）可促進質(zhì)子的轉(zhuǎn)運。術(shù)語“轉(zhuǎn)運蛋白”而不是“滲透酶”，更準(zhǔn)確地描述此類載體，在經(jīng)典酶學(xué)上不起作用。它們跨越細胞膜，并利用質(zhì)子梯度產(chǎn)生的能量催化營養(yǎng)物質(zhì)的可逆矢性轉(zhuǎn)運。

3.2 細胞壁的重要性

酵母菌細胞內(nèi)和外的溶質(zhì)運動存在幾個障礙：即包膜層、細胞壁、周質(zhì)、細胞膜和胞內(nèi)（細胞器）膜。雖然酵母細胞壁不像質(zhì)膜那樣是一種選擇性滲透屏障，但它也不是自由多孔結(jié)構(gòu)。一般酵母細胞壁被認為是多孔的，可以容納平均分子量在300 u左右的分子，可以截留700 u 左右的分子。但是，一些相對質(zhì)量高達200 ku或400 ku的大分子通常能自由擴散通過酵母細胞壁。與其他酵母細胞器一樣，細胞壁就其結(jié)構(gòu)而言應(yīng)視為動態(tài)系統(tǒng)。J. G.De Nobel 等[19]揭示了釀酒酵母細胞壁在生長和細胞分裂過程中孔隙率的變化。例如，芽生長期細胞壁孔隙比穩(wěn)定期細胞大，細胞壁處于可塑、膨脹的狀態(tài)。另外，當(dāng)經(jīng)受諸如熱沖擊的環(huán)境時，酵母細胞壁變?nèi)酰|(zhì)膜拉伸，導(dǎo)致細胞包膜對大分子（包括外源DNA）的通透性增強。

3.3 細胞膜的重要性

酵母細胞膜是將細胞與環(huán)境隔離的重要選擇性屏障，它支配著營養(yǎng)物質(zhì)的進入和代謝產(chǎn)物的排出。酵母細胞膜的轉(zhuǎn)運機制控制著酵母代謝、生長和分裂的速率，具有重要的生理意義。

值得注意的是，酵母細胞偶爾也會通過內(nèi)吞作用運輸大分子，這種方式與動物細胞中發(fā)現(xiàn)的吞噬并沒有太大的區(qū)別。例如，釀酒酵母α因子信息素可能在質(zhì)膜出芽過程中被內(nèi)化，形成核內(nèi)體并進入液泡。酵母內(nèi)吞突變體的研究為真核細胞的膜轉(zhuǎn)運提供了新見解。酵母細胞膜吸收營養(yǎng)和代謝產(chǎn)物有四種基本機制：單純擴散、促進擴散、擴散通道（孔）和主動轉(zhuǎn)運。

3.4 酵母中營養(yǎng)物質(zhì)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運

一旦營養(yǎng)物質(zhì)從細胞外培養(yǎng)基轉(zhuǎn)運穿過質(zhì)膜進入細胞內(nèi)環(huán)境，它們可以被快速代謝（分解代謝或合成代謝）或儲存起來供細胞后續(xù)使用。對于無機離子，也可以被胞漿或膜結(jié)合室（如液泡）中的細胞內(nèi)螯合劑隔離。實際上，細胞內(nèi)螯合和分隔是酵母控制其離子穩(wěn)態(tài)的主要手段。例如，酵母細胞將磷酸鹽運輸?shù)揭号葜衼砜刂萍毎|(zhì)中的正磷酸鹽濃度，在液泡中它被線性聚合成不溶性多磷酸鹽。該聚合物的儲存程度取決于生長培養(yǎng)基中磷酸鹽的可用性和細胞的代謝活躍度。在釀酒酵母液泡中磷酸鹽濃縮了是細胞質(zhì)濃度的100倍。實際上，液泡是酵母細胞內(nèi)營養(yǎng)物存儲的主要位置。該細胞器會積累二價金屬陽離子（Mg2+、Mn2+、Ca2+和Zn2+）、氨基酸（尤其是精氨酸，還有其他幾種氨基酸）和三羧酸衍生物（檸檬酸鹽、蘋果酸、α-酮戊二酸）。液泡膜吸收的主要機制是質(zhì)子營養(yǎng)反轉(zhuǎn)運。

4 酵母對大分子營養(yǎng)的轉(zhuǎn)運策略

4.1 糖類

酵母細胞轉(zhuǎn)運糖類的方式多樣，包括自由擴散、促進擴散和主動運輸[3-4]。酵母采用何種方式轉(zhuǎn)運糖類取決三個因素：酵母菌株本身、環(huán)境中存在的糖分子種類以及酵母生長的環(huán)境。酵母能利用很多己糖作為碳源，包括葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖等。通常情況下，酵母優(yōu)先轉(zhuǎn)運葡萄糖[20]。釀酒酵母中含有20 余種己糖轉(zhuǎn)運蛋白，它們的豐度和對己糖的親和力不同。與葡萄糖和單糖相比，工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基二糖的含量更高，包括蔗糖、麥芽糖、乳糖和纖維二糖等。釀酒酵母采用主動運輸方式轉(zhuǎn)運這些二糖。目前對于酵母轉(zhuǎn)運寡糖和多糖的研究較少，釀酒酵母無法轉(zhuǎn)運和利用多糖。

4.2 氨基酸和肽類

在酵母發(fā)酵工業(yè)中，發(fā)酵基質(zhì)中通常含有大量的氨基酸和肽類[21]。氨基酸不僅可以直接參與蛋白質(zhì)的合成，還可以經(jīng)分解代謝為酵母細胞提供氮源和碳源。酵母轉(zhuǎn)運氨基酸的過程包括：（1）結(jié)合，特定的受體識別氨基酸；（2）移位，細胞質(zhì)膜上的通透酶介導(dǎo)氨基酸的轉(zhuǎn)運；（3）釋放，在細胞質(zhì)中釋放氨基酸。酵母中含有兩套氨基酸攝取系統(tǒng)，一種是通用型系統(tǒng)，能攝取所有的天然氨基酸；第二種是特異性系統(tǒng)，僅能轉(zhuǎn)運一種或少數(shù)幾種氨基酸。實驗室和工業(yè)發(fā)酵常用的酵母培養(yǎng)基中含有豐富的蛋白水解物，如蛋白胨等。這些蛋白水解物的成分主要是由二肽、三肽、寡肽和多肽等。釀酒酵母中含有直接轉(zhuǎn)運二肽和三肽的系統(tǒng)，而寡肽通常需要降解成小肽和氨基酸后才能被轉(zhuǎn)運。

4.3 醇類

酵母能通過被動擴散的方式轉(zhuǎn)運小的脂溶性醇類，如甘油和乙醇等[22]。釀酒酵母的細胞質(zhì)膜在正常生長條件下對于甘油幾乎是不通透的，然而當(dāng)甘油作為唯一碳源時對甘油的轉(zhuǎn)運能力大大提高。酵母對甘油轉(zhuǎn)運的方式包括自由擴散和促進擴散。酵母不僅能通過自由擴散方式從外界攝取乙醇，也能將發(fā)酵后的乙醇自由擴散到細胞外。

4.4 脂肪酸

一些產(chǎn)油酵母能在細胞內(nèi)積累大量的脂肪酸[23]。南極假絲酵母產(chǎn)生的飽和三酰甘油最高可達到細胞干重的40%。目前已從解脂耶氏酵母中鑒定出兩套脂肪酸轉(zhuǎn)運載體蛋白，一種特異性轉(zhuǎn)運C12和C14脂肪酸，另一種轉(zhuǎn)運C16、C18和不飽和脂肪酸。

4.5 嘌呤、嘧啶和維生素

酵母利用主動運輸和促進擴散兩種方式轉(zhuǎn)運嘌呤和嘧啶，其中腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤的轉(zhuǎn)運由主動運輸介導(dǎo)，而尿嘧啶的轉(zhuǎn)運由促進擴散介導(dǎo)。酵母對于維生素的轉(zhuǎn)運是一種主動運輸過程，需要載體蛋白參與，并且這些蛋白質(zhì)對維生素的親和力很高。

5 展 望

由于酵母容易培養(yǎng)且對營養(yǎng)物質(zhì)的需求比較簡單，因此容易忽視營養(yǎng)成分對酵母培養(yǎng)的影響。酵母細胞生長和代謝與營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運效率密切相關(guān)，不同酵母對于營養(yǎng)物質(zhì)需求和轉(zhuǎn)運方式不同，因此有必要從多個角度深入研究酵母對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取方式，尤其是對大分子營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。這不僅能指導(dǎo)實驗室和發(fā)酵工業(yè)更好地培養(yǎng)酵母，還能為富集營養(yǎng)物質(zhì)的酵母類產(chǎn)品的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。