牛結(jié)節(jié)性皮膚病的實(shí)驗(yàn)室診斷與防治

桂芳/內(nèi)蒙古錫林郭勒盟烏拉蓋管理區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 026321

1 病原

病原是結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（LSDV），屬DNA 病毒羊痘的痘病毒家族包括羊痘病毒（SPV），山羊痘病毒（GPV）和LSDV，具有97%的核苷酸同一性，并且在血清學(xué)上具有交叉保護(hù)作用。盡管Capripox 的其他菌株感染綿羊和山羊，但LSDV 與牛有關(guān)。LSDV 以兩種傳染形式存在：具有單個(gè)外膜的成熟病毒體（MVS）和專門用于細(xì)胞間擴(kuò)散的包膜病毒體（EV）具有附加膜。

2 簡介

宿主對LSDV 感染的易感性受許多因素影響。CaPV 感染的免疫主要是細(xì)胞介導(dǎo)的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)子代病毒仍保留在被感染的細(xì)胞內(nèi)。通過在本地直接在細(xì)胞之間傳播，該病毒不在循環(huán)抗體的范圍內(nèi)。通過從受感染細(xì)胞中萌芽釋放的細(xì)胞外包膜病毒體，可能感染鄰近細(xì)胞或逃逸到血液中，并在全身傳播。LSDV 的傳播是通過蚊子，蒼蠅和蜱。

已知對牛的LSDV 感染具有天然抵抗力，并且亞臨床LSDV感染很常見。LSDV 造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，主要是由于導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量嚴(yán)重下降，體重減輕，流產(chǎn)，不育和生皮損害。為了成功地控制LSD，所有易感動(dòng)物的疫苗接種被認(rèn)為是主要支柱，并輔之以其他控制措施，例如撲滅，動(dòng)物移動(dòng)限制和媒介控制。

3 臨床特征

該疾病的特征是發(fā)燒、皮膚黏膜和內(nèi)臟器官上的結(jié)節(jié)性病變?？赡軙霈F(xiàn)牛奶產(chǎn)量減少，生皮受損，暫時(shí)或永久不育和受感染動(dòng)物死亡的情況，從而在受影響的國家造成重大的經(jīng)濟(jì)后果。臨床體征的嚴(yán)重程度取決于病毒的株系和被感染牛的品種。傳播主要是通過叮咬昆蟲的間接接觸。LSDV 的平均潛伏期為6 ～9d。該疾病的平均死亡率約為10%。

4 材料與方法

4.1 動(dòng)物和組織采樣從受影響的動(dòng)物中收集生物標(biāo)本。在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。從患病動(dòng)物的脖子和頭部收集結(jié)節(jié)性皮膚病變的皮膚刮擦5mL 血樣。尸檢是對表現(xiàn)出與LSD 一致的病死牛進(jìn)行的。從這些動(dòng)物中收集肺，腎，肝和心臟的一小部分進(jìn)行測試。

制備樣品，在提取DNA 之前，將皮膚樣品置于磷酸鹽緩沖液（1X PBS）中1h。一塊（約1.3cm2用剪刀將每個(gè)內(nèi)部器官（肝，腎，心臟和肺）切成小塊，并匯集在一起（總量不超過5g）。使用研缽和研棒，少量研磨加入8mL 1×PBS 的樣品。將樣品（皮膚或合并的內(nèi)部器官）勻漿。勻漿后，將漿液倒入15mL EP 中，并以8000 rpm 離心10min。將所得的上清液中提取DNA。試劑盒還可用于從血液樣本中提取DNA。研缽和研棒之間用漂白劑消毒。

4.2 實(shí)驗(yàn)室檢測抗體檢測：采集全血，分離血清用于抗體檢測，可采用病毒中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法。

4.3 病毒中和試驗(yàn)使用標(biāo)準(zhǔn)程序測試血清樣本（n= 80），該程序?qū)⒅泻椭笖?shù)確定為首選方法。針對恒定稀釋的測試血清滴定病毒株。以此方式，需要更大體積的測試血清，但是消除了確保50%組織培養(yǎng)物感染劑量（TCID50）為100 的困難。根據(jù)可用的OIE 程序，使用羊睪丸（LTe）細(xì)胞在96 孔板中進(jìn)行測試。

病原檢測：采集皮膚結(jié)痂、口鼻拭子、抗凝血等用于病原檢測。病毒核酸檢測可采用實(shí)時(shí)PCR 等方法，病毒分離鑒定可采用細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒，動(dòng)物回歸試驗(yàn)等方法。

4.4 實(shí)時(shí)PCR 測試內(nèi)部器官樣本進(jìn)行檢測。使用Taq 聚合酶，10x PCR 緩沖液，50mM MgCl 2 和10mM dNTPs 制備PCR 主混合物。將總共5μL 提取的樣品DNA 或模板對照添加到15μL 制備的預(yù)混液中，總體積為20μL。使用對應(yīng)的熱循環(huán)條件，在PCR 儀器上進(jìn)行反應(yīng)。在樣品測試之前，將陽性模板對照（PTC）從1pg/μL 連續(xù)稀釋至0.001fg/μL，并在PCR 儀器上運(yùn)行。合成循環(huán)閾值（C T）vs. PTC濃度曲線的對數(shù)給出3.76的斜率，對應(yīng)于92%的擴(kuò)增效率（每個(gè)循環(huán)100%加倍）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，在后續(xù)測量中使用濃度為1 fg/μL 的PTC。

5 控制措施

對患病動(dòng)物的治療因情況而異，但通常包括使用碘對皮膚病變進(jìn)行消毒以及用磺胺治療繼發(fā)性細(xì)菌感染。采取預(yù)防措施，包括控制動(dòng)物的活動(dòng)以及限制車輛進(jìn)入受影響農(nóng)場的交通。