兩種檢測(cè)方法在牛結(jié)核病檢疫的應(yīng)用

陳建豪 段進(jìn)剛 阿不都熱依木·賽提 張志新 玉努斯·阿不都 馬春江

（新疆哈密市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 839000)

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備

電子游標(biāo)卡尺、電動(dòng)剃毛器、肝素抗凝管、酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、微量移液器等；國(guó)產(chǎn)牛型提純結(jié)核菌素（PPD）購(gòu)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；BOVIGAMTM 牛結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自prionics 公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自哈密轄區(qū)內(nèi)部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)奶牛場(chǎng)、養(yǎng)殖戶，根據(jù)試驗(yàn)需要并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，共選取846 頭奶牛作為試驗(yàn)樣本。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)

結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)按《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)GB/T 18645-2002》規(guī)定操作進(jìn)行試驗(yàn)，在牛頸部處注射牛結(jié)核菌素（2000IU/0.1ml），72h 后觀察注射部位炎性反應(yīng)，量取皮皺厚，根據(jù)皮皺厚差值判斷結(jié)果。皮皺厚差值≥4.0mm，判為牛結(jié)核陽(yáng)性；1.0～4.0mm 判為可疑；≤0mm 判為陰性。

1.3.2 γ-干擾素ELISA 檢測(cè)法

牛尾靜脈采集皮內(nèi)PPD 變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)陽(yáng)性群牛全血5ml，置于肝素抗凝管中，輕輕顛倒混勻，室溫下16h 內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。具體操作參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行牛結(jié)核菌素和禽結(jié)核菌素刺激培養(yǎng)和γ-干擾素檢測(cè)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：牛型PPD 刺激上清的OD 值-PBS 刺激上清的OD 值≥0.1，且牛型PPD 刺激上清的OD 值-禽型PPD≥0.1。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)陽(yáng)性率的比較分析

用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)對(duì)846 頭奶牛進(jìn)行檢測(cè)，出現(xiàn)陽(yáng)性牛34 頭，個(gè)體陽(yáng)性率為4.02% (34/846)，其中牛型PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)陽(yáng)性群奶牛合計(jì)433 頭。對(duì)433 頭奶牛采集全血進(jìn)行刺激培養(yǎng)和γ-干擾素ELISA 檢測(cè)，結(jié)果TST 方法檢出陽(yáng)性34頭，陽(yáng)性率為7.85% (34/433)，IFN-γ 方法檢出牛型PPD 陽(yáng)性樣品25 份，禽型PPD 陽(yáng)性樣品6 頭，陽(yáng)性率為5.77% (25/433），結(jié)果如表1 所示。

2.2 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)與γ-干擾素ELISA 檢測(cè)比較結(jié)果

對(duì)433 份樣本用γ-干擾素ELISA 檢測(cè)與皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢出陽(yáng)性34 頭，γ-干擾素ELISA 檢測(cè)檢出陽(yáng)性25 頭，γ-干擾素ELISA 檢測(cè)與皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢出的雙陽(yáng)性牛為21 頭，雙陰性牛為395 頭，兩者之間的敏感性為84.00%，特異性為96.81%，符合率為96.07% （416/433），結(jié)果如表2 所示。

2.3 γ-干擾素ELISA 檢測(cè)不同飼養(yǎng)方式統(tǒng)計(jì)結(jié)果

由表3 可知，對(duì)433 份樣本飼養(yǎng)方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，農(nóng)區(qū)散養(yǎng)戶160 份，牧區(qū)放牧養(yǎng)殖戶125 份，規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)148 份。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，規(guī)模場(chǎng)牛結(jié)核個(gè)體陽(yáng)性率為10.81%，高于農(nóng)區(qū)散養(yǎng)5.00%，均高于牧區(qū)放牧0.30%。

3 討論

準(zhǔn)確診斷感染牛結(jié)核分枝桿菌的動(dòng)物對(duì)牛結(jié)核病的控制和進(jìn)化起至關(guān)重要的作用[1]。從檢測(cè)數(shù)據(jù)可以看出，若單獨(dú)使用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢出的PPD 陽(yáng)性牛既實(shí)行“檢疫—撲殺” 策略，必然造成假陽(yáng)性牛被誤殺。

本試驗(yàn)通過(guò)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)對(duì)846 頭奶牛進(jìn)行檢測(cè)，出現(xiàn)陽(yáng)性牛34 頭，但陽(yáng)性畜群較少，陽(yáng)性畜主要集中在小規(guī)模場(chǎng)，這與張喜悅等的研究結(jié)果相符，其發(fā)現(xiàn)規(guī)模場(chǎng)的個(gè)體陽(yáng)性率和群陽(yáng)性率均略高于散養(yǎng)戶。分析部分牛場(chǎng)可能存在牛結(jié)核分枝桿菌感染，通過(guò)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)沒(méi)有徹底根除陽(yáng)性畜，造成病原擴(kuò)散和疫情處置延誤，導(dǎo)致群內(nèi)傳播。

γ-干擾素ELISA 檢測(cè)方法比其他檢測(cè)方法有更高的靈敏度和更快速地重復(fù)檢測(cè)能力，研究表明，γ-干擾素ELISA 檢測(cè)的敏感性范圍在73.0%～100.0%之間，特異性范圍在85.0%～99.6%之間，使用γ-干擾素ELISA 檢測(cè)可以彌補(bǔ)牛結(jié)核PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的不足，疑似陽(yáng)性牛無(wú)需等待42d 后的復(fù)檢，同時(shí)能準(zhǔn)確鑒別禽型結(jié)核分枝桿菌或牛型結(jié)核分枝桿菌，這對(duì)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)來(lái)說(shuō)是一個(gè)很好的補(bǔ)充。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在同時(shí)運(yùn)用兩種方法的情況下，兩者之間的敏感性為84.00%，特異性為96.81%，符合率為96.07% （416/433），γ-干擾素ELISA 檢測(cè)的陽(yáng)性牛數(shù)量明顯減少，可有效降低因假陽(yáng)性被誤殺而造成的損失。

因此，在對(duì)牛群進(jìn)行結(jié)核病檢測(cè)時(shí)，可結(jié)合當(dāng)?shù)貙?shí)際情況開展工作。進(jìn)而達(dá)到有效控制牛結(jié)核病傳播的目的。哈密市域多數(shù)養(yǎng)殖戶、農(nóng)牧民實(shí)行春冬輪牧，夏季放牧、冬季舍飼的方式，牛場(chǎng)的地理位置是牛結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)因素之一[2]。分析不同飼養(yǎng)方式，陽(yáng)性率從高到低分別為規(guī)模場(chǎng)、農(nóng)區(qū)、牧區(qū)，規(guī)模場(chǎng)高發(fā)原因?yàn)殛?yáng)性畜主要集中在其中一個(gè)規(guī)模場(chǎng)，推測(cè)更為深層次的原因可能與飼養(yǎng)模式和牛群密度等有關(guān)。分析不同品種，土種奶牛陽(yáng)性率最低，其次分別是西蒙塔爾和荷斯坦奶牛，這可能與荷斯坦奶牛更易感病有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

表1 不同方法檢測(cè)陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表2 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)與γ-干擾素ELISA 檢測(cè)比較結(jié)果

表3 不同飼養(yǎng)方式γ-干擾素ELISA 檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果