紫花杜鵑的HPLC指紋圖譜及聚類分析

李川晶，孫 琦，南敏倫，白 雪，張家賀，赫玉芳，5，趙全成

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)·吉林 長春 130118；2吉林正容醫(yī)藥發(fā)展有限責(zé)任公司·吉林 敦化 133700；3吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院·吉林 長春 130012；4吉林吉春制藥股份有限公司·吉林 四平 136504；5長春中醫(yī)藥大學(xué)·吉林 長春 130117)

紫花杜鵑為杜鵑花科植物紫花杜鵑(RhododendronmariaeHance)干燥葉或帶葉嫩枝[1]。被1977年版《中國藥典》收載為藥材品種。據(jù)研究表明紫花杜鵑具有抑菌抗炎、抗血小板聚集、鎮(zhèn)痛的功效[2-3]，臨床應(yīng)用治療慢性支氣管炎。目前對紫花杜鵑質(zhì)量控制的研究主要集中在槲皮素的含量測定，但是單一成分含量不能作為評價藥材質(zhì)量好壞的依據(jù)，《中國藥典》也未有紫花杜鵑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范，導(dǎo)致紫花杜鵑質(zhì)量不可控，所以本文選取3個省份4個產(chǎn)區(qū)共13批藥材樣品對其中6種成分進(jìn)行指認(rèn)，有利于控制紫花杜鵑質(zhì)量，為該藥材進(jìn)一步的開發(fā)研究提供有效依據(jù)。

由于中藥材組分復(fù)雜，建立有效的檢測方法極其重要，黃輝強(qiáng)等運(yùn)用超高效液相色譜與串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC/Q-TOF-MS)分析紫花杜鵑黃酮類成分[4]，該技術(shù)有分離度高，速度快，靈敏度高等優(yōu)點，但UPLC/Q-TOF-MS對于樣品前期處理較復(fù)雜，檢測成本較高，儀器設(shè)備不普遍，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及含量測定的日常研究受到限制。因此，本文以指紋圖譜對不同產(chǎn)地不同批次紫花杜鵑進(jìn)行質(zhì)量探究，指紋圖譜從整體角度對藥材質(zhì)量的檢測更完善，能系統(tǒng)的觀察到中藥所含的化學(xué)成分和含量，為進(jìn)一步控制中藥材的質(zhì)量奠定依據(jù)[5]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1220：安捷倫公司；BS 124S電子天平：METTLER TOLEDO 儀器有限公司；KQ-250A型超聲波清洗器：北京科偉永興儀器有限公司；XTP-500A高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司。

1.2 試藥 槲皮素、槲皮苷、金絲桃苷、蕓香苷、山柰酚和齊墩果酸對照品：均購于中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：100081-201610、111538-201606、110861-201310、111521-201205、110709-201206、100080-201610，；水為娃哈哈純凈水；乙腈、磷酸為色譜純；實驗所用紫花杜鵑藥材于2018年4月—2018年6月采自3 個省份4 個產(chǎn)區(qū)，由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院趙全成教授鑒定均為杜鵑花科杜鵑屬真品，13批樣品的信息見表1。

表1 紫花杜鵑樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蕓香苷、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、齊墩果酸和山柰酚適量，用甲醇溶解制備得到每毫升含蕓香苷0.0 101 mg、金絲桃苷0.0 128 mg、槲皮苷0.0 753 mg、槲皮素 0.0 230 mg、齊墩果酸0.2 010 mg和山柰酚0.0 212 mg的對照品混合溶液。

2.2 供試品溶液的制備 紫花杜鵑藥材干燥葉粉碎(過60目篩)，取粉末0.5 g，精密稱取，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，水浴回流1 h，放置室溫，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱為ACE C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A(乙腈)、B(0.2%磷酸水)，梯度洗脫：0～32 min A 由10%升至19%；32～50 min A由19%升至30%；50～60 min A由30%升至40%；60～70 min A由40%升至50%；70～80 min A由50%升至60%；80～90 min A由60%升至70%；90～100 min A 由70%升至90%；100～105 min A由90%降至10%；105～110 min A保持10%；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為280 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取S3樣品，按“2.2”方法處理供試品溶液，以“2.3”項下色譜條件分別進(jìn)樣6次，結(jié)果目標(biāo)峰相對保留時間的RSD<0.59%，相對峰面積的RSD<1.03%；表明本方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取S3樣品，按“2.2”方法處理供試品溶液，以“2.3”項下色譜條件分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣，檢測目標(biāo)峰，結(jié)果目標(biāo)峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于0.45%表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取S3樣品，按“2.2”方法處理供試品溶液，以“2.3”項下色譜條件分別進(jìn)樣6次，結(jié)果目標(biāo)峰相對保留時間的RSD<0.39%，相對峰面積的RSD<0.61%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜分析

2.5.1 指紋圖譜的建立 取13批紫花杜鵑供試液，按“2.3”項下色譜條件依次進(jìn)樣檢測，色譜圖見圖1。用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件進(jìn)行處理，確定16個共有峰見圖2。

圖1 13 批不同產(chǎn)地紫花杜鵑指紋圖譜

圖2 紫花杜鵑指紋圖譜共有模式圖

2.5.2 色譜峰的指認(rèn) 在16個共有峰參考下，經(jīng)對照品的色譜圖比對，確定6個色譜峰。見圖3。

2.5.3 參比峰的選擇 由于金絲桃苷在各批次紫花杜鵑中均含有，分離效果好、峰面積大，故選擇金絲桃苷作為參比峰。

2.6 紫花杜鵑藥材指紋圖譜的評價

2.6.1 紫花杜鵑藥材樣品HPLC指紋圖譜相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)對紫花杜鵑圖譜分析處理，得到相似度評價結(jié)果見表2，相似度可以體現(xiàn)出不同產(chǎn)地不同批次樣品之間成分和含量的相似程度，13批紫花杜鵑藥材的相似度均在0.9以上，個別樣品含量有差異，可能受樣品產(chǎn)地和采摘時間的影響。

4.槲皮素；5.槲皮苷；9.金絲桃苷；11.蕓香苷；12.山柰酚；16.齊墩果酸圖3 高效液相混合對照品色譜圖

表2 13批紫花杜鵑藥材樣品相似度評價結(jié)果

2.6.2 各產(chǎn)地藥材指紋圖譜的聚類分析 以3個省份4個產(chǎn)區(qū)的13批紫花杜鵑樣品進(jìn)行指紋圖譜的分析，應(yīng)用SPSS 19.0軟件分析[6]，采用組間聯(lián)結(jié)法，以歐式距離平方為度量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見圖4。紫花杜鵑藥材S1-S4首先聚為一類；其余批次為一類，在上述的分類基礎(chǔ)上，其余批次分為兩類，其中S5、S8、S1、S6、S2聚為一類，S4、S9、S7、S3聚為一類。

圖4 紫花杜鵑樣品聚類分析樹狀關(guān)系

3 討論

3.1 提取溶劑和提取方式的選擇 實驗對比超聲和回流2 種提取方法，超聲雖操作簡單，但峰個數(shù)極少，回流法提取效率更高；考察水、50%甲醇、甲醇、95%乙醇作為提取溶劑[7]，結(jié)果表明水和95%乙醇作溶劑時，色譜峰數(shù)量少，50%甲醇、甲醇作溶劑時峰型較好，峰數(shù)量無明顯差別，但甲醇作溶劑時色譜峰面積更大，故選擇甲醇回流提取法。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 通過對甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸水和乙腈-0.2%磷酸水、4個流動相系統(tǒng)進(jìn)行等度洗脫對比分析[8-9]，結(jié)果顯示達(dá)不到峰的有效分離，而且甲醇流動相比例過大會使UPLC柱壓升高，基線不穩(wěn)，故進(jìn)一步對乙腈-水、乙腈-磷酸水進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果乙腈-0.2%磷酸水流動相，峰數(shù)目多且分離度好。同時考察波長254、280、365 nm及柱溫30 ℃和35 ℃對色譜峰保留時間的影響，結(jié)果顯示本實驗選用的色譜條件為最佳。

3.3 相似度結(jié)果及聚類分析方法評價 本文建立紫花杜鵑指紋圖譜，從13批樣品的重疊圖譜中確定16個共有峰，與對照品圖譜比較指認(rèn)6種成分，每批樣品非共有峰與總峰面積比值< 20%，符合指紋圖譜要求。通過相似度和聚類分析的實驗，結(jié)果表明13批紫花杜鵑樣品相似度在0.939～1.000，不同地區(qū)的樣品峰面積有差異，但共有峰保留時間的RSD無明顯差別，說明不同省份及產(chǎn)區(qū)的成分相近，但含量不同，樣品質(zhì)量也存在差異。通過聚類分析圖可見，13批紫花杜鵑聚為2 類，S10～S13為Ⅰ類，產(chǎn)自廣東羅定樣品相似度高，采摘期對成分基本無影響，質(zhì)量較好；S1～S9為Ⅱ類，樣品含量和成分受采摘期和產(chǎn)地氣候影響有差別，Ⅱ類樣品分別產(chǎn)自廣東省、云南省、四川省，說明該地區(qū)間紫花杜鵑存在親緣聯(lián)系，可進(jìn)一步探究，紫花杜鵑主采收期為5月份，廣東羅定產(chǎn)區(qū)質(zhì)量穩(wěn)定，為紫花杜鵑藥材的道地性提供科學(xué)依據(jù)，本實驗操作簡便實用性強(qiáng)，為紫花杜鵑藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒別提供依據(jù)，為成分的進(jìn)一步分析奠定基礎(chǔ)。