頭部運(yùn)動(dòng)區(qū)電針刺激對(duì)腦癱大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞自噬的調(diào)控作用

高 晶，梅潤(rùn)宏，何璐娜，周桂超，王莉娜，于雪峰

(1江蘇省淮安市婦幼保健院·江蘇 淮安 223002；2南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院·江西 南昌 330003)

腦癱(cerebral palsy，CP)是兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病中致殘率極高的疑難病和多發(fā)病，嚴(yán)重危害兒童的身心健康。促進(jìn)腦癱神經(jīng)功能康復(fù)效果及作用機(jī)制研究，仍是當(dāng)前世界醫(yī)學(xué)界研究的一大熱點(diǎn)[1]。在治療腦癱的眾多方法中，電針刺激頭部運(yùn)動(dòng)區(qū)療法，因更具有簡(jiǎn)便易行、療效顯著、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，已得到眾多學(xué)者及臨床醫(yī)生的認(rèn)可，但其作用機(jī)制研究尚少，缺乏評(píng)估治療效果的科學(xué)依據(jù)[2-3]。最新研究證明：新生兒CP模型的主要病理改變是大腦皮層的缺血缺氧性損害，顯示出3種形態(tài)上不同的細(xì)胞死亡，即細(xì)胞凋亡、壞死和自噬[4]。本文對(duì)電針刺激頭部運(yùn)動(dòng)區(qū)調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞自噬，促進(jìn)腦癱神經(jīng)功能康復(fù)的觀察效果做如下報(bào)道。

1 材料

健康7日齡健康SD大鼠，清潔級(jí)，90只，雌雄各半，精確稱重，體質(zhì)量12～18 g，由南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)-2008-0004。蘇木精、伊紅試劑：武漢欣欣佳麗生物科技有限公司；醋酸鈾試劑：西安鼎天化工有限公司。BT701-1B型針灸電針儀：購(gòu)于上海華誼醫(yī)用儀器有限公司；CX43奧林巴斯顯微鏡、JEM-1010 型透射電子顯微鏡：日本電子株式會(huì)社。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型制備及處理 將90只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組和頭針組，每組30只。假手術(shù)組：分離左頸總動(dòng)脈不結(jié)扎，縫合切口，不做缺氧處理。不給予任何干預(yù)治療。模型組：按照國(guó)際公認(rèn)改良的HIE實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模方法造模[5]。頭針組：造模24 h后進(jìn)行頭部運(yùn)動(dòng)區(qū)電針刺激。參照《頭針穴名國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化方案》[6]選擇頭部運(yùn)動(dòng)區(qū)，以顳前線、頂顳前斜線定位，針刺運(yùn)動(dòng)區(qū)頭皮表面投影上2/5；造模后24 h開始，毫針淺刺，按一定方向沿皮下緩慢捻轉(zhuǎn)進(jìn)針，達(dá)到應(yīng)有深度，進(jìn)針后接通電針儀，正極、負(fù)極接左右針尾，頻率 2 Hz，疏密波形，電流3.5 mA,每日1 次,每次3 min，7次為1 個(gè)療程，停針2 d進(jìn)入下一個(gè)療程，共3 個(gè)療程。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 神經(jīng)功能狀況評(píng)估 于造模后7、14、28 d每組各取10只實(shí)驗(yàn)大鼠，處死取樣前按Bederson 法[7]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)。

2.2.2 光學(xué)顯微鏡觀察受損腦組織病理學(xué)改變 于造模后7、14、28 d每組隨機(jī)取10只實(shí)驗(yàn)大鼠,神經(jīng)功能評(píng)價(jià)后，10%的水合氯醛按3 mL/kg劑量進(jìn)行腹腔麻醉，斷頭處死,病理取材，切取大腦皮層1 mm×1 mm×1 mm組織塊, 樣本處理后，常規(guī)HE染色，制片，觀察、拍照。

2.2.3 透射電鏡觀察受損腦組織神經(jīng)細(xì)胞自噬變化 取材過程同2.2.2，待組織固定后，取出切成1 mm3大小3塊，用4%的戊二醛固定4 h，1%的鋨酸固定1 h，逐級(jí)乙醇丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618#包埋后，超薄切片，枸櫞酸鉛、醋酸鈾雙重染色，透射電鏡觀察受損腦組織超微結(jié)構(gòu)及神經(jīng)細(xì)胞自噬變化。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠各時(shí)段運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估結(jié)果 見表1。

表1 各組大鼠各時(shí)段運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較分)

3.2 各組大鼠腦組織病理學(xué)光鏡觀察結(jié)果 假手術(shù)組大鼠在各時(shí)段表現(xiàn)一致，腦組織結(jié)構(gòu)完好，神經(jīng)細(xì)胞大小均勻，依靠緊密，細(xì)胞核飽滿。7 d時(shí)，模型組腦組織結(jié)構(gòu)疏松，間質(zhì)水腫，區(qū)域內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞染色深，幾乎所有細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，腦損傷嚴(yán)重；頭針組與模型組改變基本相同，但間質(zhì)水腫程度稍輕。14 d時(shí)，模型組細(xì)胞染色依舊較深，可見很多鬼影細(xì)胞，但頭針組腦組織水腫幾乎消失，可見完好細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)入損傷組織，鬼影細(xì)胞少量。28 d時(shí)，各組腦組織切片均可見恢復(fù)現(xiàn)象，但頭針組腦組織結(jié)構(gòu)更加緊密，且?guī)缀鯖]有固縮細(xì)胞核存在。見圖1。

圖1 各組大鼠第14 天腦組織光鏡觀察(HE，×400)

3.3 各組大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察結(jié)果 假手術(shù)組可見雙層模包繞內(nèi)容物現(xiàn)象,自噬少見。模型組見神經(jīng)細(xì)胞水腫，細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，線粒體絕大部分嵴和部分膜融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，有明顯的自噬現(xiàn)象，但以單層模為主。頭針組：隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)細(xì)胞水腫逐漸消失，細(xì)胞器數(shù)量明顯增多，線粒體嵴斷裂減少，空泡樣改變明顯改善，可見呈雙層或多層膜包繞內(nèi)容物的自噬現(xiàn)象，但少于模型組，第14天差異明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠第14天腦組織神經(jīng)細(xì)胞自噬的電鏡觀察(×37 000)

4 討論

以往有關(guān)腦癱早期病理進(jìn)程及促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)方法機(jī)制研究多偏于神經(jīng)元凋亡，而越來(lái)越多的研究證據(jù)表明，自噬參與了神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)元分化和神經(jīng)損傷性疾病，而凋亡與自噬之間存在著復(fù)雜的交互作用，有效阻止神經(jīng)元過度凋亡與自噬，可有效減輕腦組織損害[4]。以往本課題組臨床觀察及實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)電針刺激頭部運(yùn)動(dòng)區(qū)治療腦癱方法簡(jiǎn)便、安全療效，已得到同行認(rèn)可[8]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建腦癱大鼠動(dòng)物模型，對(duì)電針刺激頭部運(yùn)動(dòng)區(qū)調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞自噬，促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)效果進(jìn)行觀察。研究發(fā)現(xiàn)模型組不同時(shí)間段的運(yùn)動(dòng)功能障礙嚴(yán)重，神經(jīng)功能評(píng)分均較較假手術(shù)組低(P<0.05)，受損腦組織病理觀察提示神經(jīng)細(xì)胞死亡較多，神經(jīng)細(xì)胞自噬明顯；而頭針組的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分在各時(shí)段均有增加，神經(jīng)細(xì)胞自噬趨勢(shì)減弱。上述研究結(jié)果說(shuō)明在腦癱缺血缺氧腦損傷過程中，神經(jīng)細(xì)胞過度自噬導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡增加，神經(jīng)功能障礙嚴(yán)重；而電針刺激頭部運(yùn)動(dòng)區(qū)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞自噬有調(diào)控作用，可有效減輕腦癱腦損害，促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù),但調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。