芒柄花素磺酸鈉對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

包成, 李鐵成

1丹東市第一醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地麻醉科(遼寧丹東 118000) ； 2 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科(遼寧錦州 121000)

心血管疾病是全球病死率最高的疾病，其中急性心肌梗死(acute myocardial Infarction, AMI)發(fā)病極為兇險(xiǎn),后果最為嚴(yán)重[1]。現(xiàn)有的有效治療手段主要有溶栓術(shù)，經(jīng)皮冠脈介入治療等臨床方法，通過(guò)醫(yī)學(xué)手段實(shí)現(xiàn)血流再通[2]。但在實(shí)現(xiàn)心肌缺血再灌注的同時(shí)，部分患者心肌缺血癥狀反而加重，甚至出現(xiàn)了心肌細(xì)胞的大面積壞死的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱(chēng)為缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury, I/R)，發(fā)病機(jī)制主要有氧自由基的增加，鈣超載，炎癥因子的作用及能量代謝障礙等[3-4]。減輕心肌缺血再灌注損傷是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題，藥物的預(yù)處理是近年來(lái)的醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)。據(jù)研究表明芒柄花素對(duì)心血管有一定的保護(hù)作用，且有較強(qiáng)的抗炎作用，可以抑制各種炎性因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的釋放和表達(dá)，可防治以炎癥為基礎(chǔ)的疾病演變[5]。但由于芒柄花素難溶解于水，而芒柄花素磺酸鈉(sodium formononetin-3′-sulfonate，Sul-F)是芒柄花素的磺化產(chǎn)物，在不影響藥理作用的前提下大幅度提高了水溶性[6]。因此，2019年6—9月，本研究通過(guò)構(gòu)建心肌缺血再灌注SD大鼠模型，觀察芒柄花素磺酸鈉對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，從而為心肌缺血的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 芒柄花素磺酸鈉(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：N0922A)。

1.2 動(dòng)物 SD健康雄性大鼠(錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。

1.3 試劑 髓過(guò)氧化酶(MPO)試劑盒(南京建成生物公司)，TNF-α試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，IL-1β試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，肌酸激酶(CK-MB)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.4 儀器 小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟軟件有限公司)，心電監(jiān)護(hù)儀(北京邁瑞醫(yī)療)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices 公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法 選擇健康雄性SD大鼠32只，每只體重范圍240～300 g,隨機(jī)分成4組，每組8只，分別為假手術(shù)組、缺血再灌注模型組(模型組)、芒柄花素磺酸鈉高劑量組(高劑量組)、芒柄花素磺酸鈉低劑量組(低劑量組)。大鼠稱(chēng)重分組后，術(shù)前12 h禁食，可正常飲水。前5 d給予不同劑量芒柄花素磺酸鈉的預(yù)處理，低劑量組20 mg/kg，高劑量組40 mg/kg。假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水安慰劑。其中假手術(shù)組，冠狀動(dòng)脈左前降支下穿線，不結(jié)扎，其余3組均給予結(jié)扎30 min，再灌注120 min。

1.5.1 造模方法 將大鼠用20%的烏拉坦溶液腹腔注射麻醉后，固定于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)，氣管插管后固定行機(jī)械通氣。吸氣與呼氣的比約為1∶2，潮氣量30 mL/kg。提起表皮于四肢皮下輕刺入針形電極，監(jiān)測(cè)并記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖。選取胸骨左緣3～4肋間處作一切口，開(kāi)胸并暴露心臟，用無(wú)創(chuàng)縫合線穿過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支的下方約2 mm處，位于左心耳與肺圓錐動(dòng)脈之間，再將縫線穿過(guò)自制的套管，系緊縫線阻斷血流30 min左右，再剪短繩結(jié)給予再灌注120 min。以監(jiān)測(cè)系統(tǒng)心電圖的ST段抬高幅度≥0.15～0.2為結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)，而再灌注后ST段回落幅度超過(guò)50%為再灌注成功標(biāo)志[7]。

1.5.2 指標(biāo)檢測(cè)方法 以上各組于再灌注末期取血，滴入離心管，將離心管放置于離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心10 min，取血清。用比色法測(cè)定MPO的活性,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測(cè)定CK-MB、TNF-α和IL-1β的活性,以上各項(xiàng)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)執(zhí)行。剪掉心臟，將心尖放置于甲醛溶液中冷藏保存，心肌組織放置于-80℃的深凍冰箱中保存。組織切片做HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的病理變化。

2 結(jié)果

2.1 各組心律失常的發(fā)生率 與假手術(shù)組比較，各組均有心律失常的發(fā)生，而高劑量組、低劑量組的室性心律失常的發(fā)生率遠(yuǎn)小于模型組，高劑量組的作用強(qiáng)于低劑量組。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心律失常的發(fā)生率

2.2 芒柄花素磺酸鈉對(duì)I/R大鼠心肌損傷程度的影響 在HE染色后，可以明顯見(jiàn)到假手術(shù)組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)異常，而模型組大量細(xì)胞核溶解，固縮，部分細(xì)胞核碎裂，肌纖維紊亂，且伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。高劑量組、低劑量組處理后的心肌損傷有明顯改善，細(xì)胞損傷較輕，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

2.3 芒柄花素磺酸鈉對(duì)I/R大鼠血清中CK-MB、MPO、TNF-α及IL-1β活性的影響 (1)TNF-α的含量，模型組遠(yuǎn)高于假手術(shù)組(P<0.001)、低劑量組(P<0.001)和高劑量組(P<0.001)，且高劑量組優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。(2)IL-1β的含量,低劑量組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但假手術(shù)組<高劑量組<低劑量組<模型組，高劑量組與低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(3)大鼠心肌損傷后MPO的含量大幅度增加，經(jīng)過(guò)芒柄花素磺酸鈉20、40 mg/kg處理后，各組MPO含量有所減少，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。(4)與模型組相比，給藥后的各組CK-MB的釋放明顯減少(P<0.01)。見(jiàn)表2。

注：A:假手術(shù)組；B:模型組;C:低劑量組;D:高劑量組；于400倍視野下觀察，給藥組大鼠心肌損傷程度明顯減輕，高劑量組優(yōu)于低劑量組

表2 芒柄花素磺酸鈉對(duì)心肌缺血再灌注大鼠血清中各項(xiàng)生化指標(biāo)的影響

3 討論

藥物的干預(yù)是近年來(lái)心肌缺血再灌注損傷的一個(gè)研究熱點(diǎn)，而炎癥因子在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。MPO代表著中性粒細(xì)胞的活化程度，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，因此MPO可以預(yù)測(cè)心肌損傷的嚴(yán)重程度[8-9]。Calmarza等[10]研究顯示 MPO水平的變化與急性冠脈綜合征明顯正相關(guān)(P<0.001)，MPO于再灌注早期就有所表達(dá)，表達(dá)程度可能與心肌梗死面積相關(guān)，主要功能是形成具有氧化作用的自由基，造成心肌損傷。同樣當(dāng)心肌損傷時(shí)，大量的心肌酶如CK-MB會(huì)釋放入血，血液中的酶含量急劇升高，心肌損傷則進(jìn)一步加重。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠血清中MPO、CK-MB的含量遠(yuǎn)高于其他三組，說(shuō)明了芒柄花素磺酸鈉對(duì)心肌有一定的保護(hù)作用。

TNF-α和IL-1β于再灌注早期發(fā)揮了重要作用[11]。在炎癥反應(yīng)的過(guò)程中由于中性粒細(xì)胞的大量聚集導(dǎo)致血管堵塞再灌注效果不理想，同時(shí)會(huì)釋放出大量的TNF-α和IL-1β[12-13]。TNF-α可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合產(chǎn)生的過(guò)氧化物陰離子通過(guò)刺激髓過(guò)氧化物酶產(chǎn)生更多的炎性因子，從而加重炎癥反應(yīng)。IL-1β由單核巨噬細(xì)胞分泌，持續(xù)升高會(huì)加重心肌損傷，且IL-1β與TNF-α有協(xié)同作用[13]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)芒柄花素磺酸鈉可以抑制TNF-α和IL-1β的過(guò)度表達(dá)，可見(jiàn)芒柄花素磺酸鈉對(duì)心肌缺血再灌注時(shí)損傷的保護(hù)作用可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。