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    苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖的條件優(yōu)化研究

    2021-01-08 01:21:46黃鳳柳
    韶關(guān)學(xué)院學(xué)報 2020年12期
    關(guān)鍵詞:佛手瓜濃硫酸水溶性

    黃 麗,黃鳳柳

    (廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院 熱帶農(nóng)林學(xué)院,廣東 廣州 510507)

    佛手瓜,又名合掌瓜、拳頭瓜、福壽瓜,是一種具有豐富營養(yǎng)價值和極高藥用價值的綠色蔬菜[1].但由于其口感欠佳,限制了佛手瓜的推廣,對佛手瓜進行深加工、延長產(chǎn)業(yè)鏈、增加附加值勢在必行.近年來,針對佛手瓜的研究大多是初加工,目前已開發(fā)的產(chǎn)品有酸奶、果脯、蜜餞、蔬菜酒、果醬及腌制品等,但這些產(chǎn)品存在技術(shù)含量和營養(yǎng)附加值不高的缺點[2].佛手瓜富含多種活性物質(zhì),包括來自于葉子的抗氧化提取物、從種子中分離出的某些胰島素抑制因子、乳汁中含有的植物凝集素、果肉中富含的果膠、黃酮以及對巨噬細胞功能有調(diào)節(jié)作用的生物活性多糖等[3-6].對佛手瓜中活性物質(zhì)的提取及其相關(guān)產(chǎn)品的深加工日益成為國際研究熱點和難點.其中多糖具有降血糖、降血脂、抗病毒等多種生物活性功能,備受人們關(guān)注,研究佛手瓜種多糖的提取,然后進行相應(yīng)的深加工具有較強的應(yīng)用價值.國外關(guān)于佛手瓜水溶性多糖的研究和探索多有報道[7-8].但是,國內(nèi)關(guān)于佛手瓜多糖的研究尚處于初步階段,相關(guān)提取工藝研究的報道目前只有熱水浸提法[9]和超聲波輔助法[10].兩種方法均提取的是粗多糖,對多糖的純化、結(jié)構(gòu)和活性并沒有進一步研究.因此,為了對以多糖為有效活性成分的佛手瓜原料和佛手瓜多糖產(chǎn)品的質(zhì)量有一個比較和評判標(biāo)準,研究佛手中瓜水溶性多糖含量測定方法具有一定的實際意義.

    多糖含量的檢測方法主要可以分為兩類:一是高效液相或酶法,高效液相法需要昂貴儀器和多糖純品,酶法則需要特定的酶,以上兩種方法都是直接測定多糖本身,操作步驟均較繁瑣.二是地衣酚-鹽酸法、蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法,這幾種方法具有簡便和快速的優(yōu)點,但是,地衣酚-鹽酸法因為所用試劑昂貴且用量大,不通用;蒽酮-硫酸法存在較嚴重的穩(wěn)定性問題,容易被色氨酸含量較高蛋白質(zhì)所影響,且重現(xiàn)性不好;關(guān)于多糖的含量測定大都采用苯酚-硫酸法,但該法也存在平行樣品之間的吸光度相差較大、檢測的重現(xiàn)性與準確性不好等缺點[11].因此,本研究從檢測波長、樣品添加順序、試劑用量、顯色測定條件等方面進行了苯酚-硫酸法測定佛手瓜中水溶性多糖的首次研究,并研究了其線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率等,以期得出苯酚-硫酸法測定佛手瓜中水溶性多糖含量的最佳測定條件,從而為佛手瓜中多糖提取以及利用活性物質(zhì)進行佛手瓜的精深加工提供參考.

    1 試劑與方法

    1.1 材料與試劑

    綠皮佛手瓜,購自增城中新鎮(zhèn)超市;葡萄糖、苯酚、濃硫酸、石油醚、正丁醇、氯仿等試劑均為分析純;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4)、子華牌循環(huán)水真空泵(B-2-DⅡ)、布氏漏斗(實驗室提供)、分光光度計(N723)、恒溫烘箱(101-3)、高速粉碎機(SN-400)、高速離心機(廣豐科技).

    1.2 試驗方法

    1.2.1 材料的制備和溶液的配制

    佛手瓜樣品制備:佛手瓜去皮去核,切片,60 ℃烘箱中烘干,粉碎過80目篩即得.

    佛手瓜多糖溶液配制:取適量佛手瓜樣品用石油醚回流1 h去除脂肪,曬干樣品,往燒杯中倒入脫脂后的樣品,添加20倍質(zhì)量的水,放入81 ℃恒溫水浴鍋中(需要保鮮膜包住燒杯,并不時攪拌),熱水浸提138 min,抽濾得濾液.濾液中加入Servage試劑(濾液∶氯仿∶正丁醇=16∶4∶1),萃取去除蛋白及有機溶劑,將上清液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中,稀釋定容.

    佛手瓜多糖粉末制備:重復(fù)佛手瓜多糖溶液配制過程的脫脂、水提、脫蛋白操作,往上清液中加入無水乙醇,使乙醇體積分數(shù)為80%,過夜醇沉12 h,離心,干燥至恒重即可得.

    葡萄糖標(biāo)準溶液配制:精確稱取干燥至恒重的葡萄糖0.015 0 g于250 mL容量瓶中,加水至刻度,搖勻,即可得60 ug/mL的葡萄糖標(biāo)準溶液.

    1.2.2 苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖條件優(yōu)化

    (1)最大吸收波長的確定

    分別吸取佛手瓜水溶性多糖溶液和葡萄糖標(biāo)準溶液2 mL,以空白試劑為對照,加入6%苯酚1 mL,搖勻,加入濃硫酸5 mL搖勻,放置5 min,沸水浴15 min,取出后冷卻到室溫,在波長范圍為400~600 nm內(nèi)采用紫外可見分光光度計測定吸光度,記錄其最大吸收值對應(yīng)的波長.

    (2)試劑添加順序的確定

    以空白試劑為對照,固定佛手瓜水溶性多糖溶液和試劑用量:佛手瓜水溶性多糖溶液2 mL(P),6%苯酚溶液1 mL(B),濃硫酸5 mL(N),改變樣品添加順序:PBN、BPN、BNP、NBP 、PNB,放置5 min,沸水浴15 min,取出后冷卻到室溫,測定吸光度,確定其樣品添加順序.

    (3)試劑用量的確定

    濃硫酸用量分別控制在 4.0,4.5,5.0 ,5.5,6.0,6.5 mL,以試劑空白為空白對照.測定吸光度,得出最適濃硫酸用量. 6%苯酚的用量分別控制在 0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2 mL,以試劑空白為空白對照.測定吸光度,得出最適苯酚用量.試驗中苯酚應(yīng)避光保存,防止苯酚被氧化影響顯色效果.

    (4)顯色測定條件

    顯色溫度分別控制在20、40、60、80 ℃,以試劑空白為空白對照.測定吸光度,得出最適顯色溫度.顯色時間分別控制在5、10、15、20、25 min,以試劑空白為空白對照.測定吸光度,得出最適顯色時間.

    1.2.3 換算因子和多糖含量的計算

    (1)葡萄糖標(biāo)準曲線的繪制

    分別吸取葡萄糖標(biāo)準溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于比色管中,加水至刻度,搖勻,即得12、24、36、48、60 ug/mL的葡萄糖標(biāo)準使用液,以試劑空白為空白對照,根據(jù)上述試驗優(yōu)化的苯酚-硫酸法進行測定,繪制葡萄糖標(biāo)準溶液曲線.

    (2)換算因子的計算

    式中:m佛手瓜多糖粉末的質(zhì)量(mg),c備用液中佛手瓜多糖葡萄糖質(zhì)量濃度(mg·mL-1),d備用液稀釋倍數(shù).

    (3)水溶性多糖含量的計算

    準確稱取材料制備中干燥得到的佛手瓜樣品10 g,脫脂、水提和脫蛋白,將萃取后得到的上清液定容,得到樣品液,以空白試劑為對照,參照公式(2)來計算佛手瓜水溶性多糖含量.

    式中:C樣品中葡萄糖質(zhì)量濃度(ug·mL-1),D樣品液稀釋倍數(shù),F(xiàn)換算因子,M佛手瓜的樣品質(zhì)量(g).

    1.2.4 苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖方法學(xué)驗證試驗

    (1)精密度試驗

    吸取5份佛手瓜水溶性多糖溶液2 mL,根據(jù)上述優(yōu)化后的苯酚-硫酸法進行測定,重復(fù)測定5次,計算相對標(biāo)準偏差RSD值(n=5),驗證方法的精密度.

    (2)穩(wěn)定性試驗

    綜上所述:腦卒中篩查中采納頸動脈超聲,可有效診斷出頸動脈狹窄程度及其血流參數(shù),并分析其超聲特征,值得臨床信賴并進一步推廣。

    吸取1份佛手瓜水溶性多糖溶液2 mL,根據(jù)上述優(yōu)化后的苯酚-硫酸法進行測定,每隔30 min測1次吸光度值,考察3 h內(nèi)佛手瓜水溶性多糖的穩(wěn)定性,計算RSD值(n=6),驗證顯色液及方法的穩(wěn)定性.

    (3)加樣回收率試驗

    取5個比色管,分別加入1 mL佛手瓜水溶性多糖溶液和1 mL葡萄糖標(biāo)準溶液,根據(jù)上述優(yōu)化后的苯酚-硫酸法進行測定,計算加樣回收率,計算RSD值(n=5).

    2 結(jié)果與分析

    2.1 苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖條件優(yōu)化

    2.1.1 最大吸收波長的確定

    佛手瓜多糖在苯酚-濃硫酸作用下生成絡(luò)合衍生物,其組分較單一,顯色效果較好[13].佛手瓜多糖溶液和葡萄糖標(biāo)準溶液在400~600 nm的波長范圍內(nèi)掃描結(jié)果如圖1所示.由圖1可知,佛手瓜多糖溶液和葡萄糖標(biāo)準溶液均在485 nm處有最大吸收,確定最大吸收波長為485 nm.

    圖1 最大吸收波長的確定

    2.1.2 試劑添加順序的確定

    陰婉婷等人測定蛹蟲草多糖含量研究時,改變濃硫酸及苯酚的加入順序會使產(chǎn)物穩(wěn)定,靈敏度提高,并具良好重現(xiàn)性[14].本文嘗試改變試劑添加順序研究其對吸光度值的影響,如圖2所示.結(jié)果表明,吸光度按依次減弱的順序為:PBN>BPN>BNP>NBP>PNB,因此,吸光度最大時試劑最佳添加順序是PBN,即佛手瓜多糖溶液,苯酚,濃硫酸.這可能是因為濃硫酸的添加會快速水解多糖,所以要放在最后;而先加入苯酚會使反應(yīng)更充分,所以要放在前面.

    圖2 樣品添加順序?qū)ξ舛鹊挠绊?/p>

    2.1.3 試劑用量的確定

    (1)濃硫酸用量

    濃硫酸用量是反應(yīng)顯色過程的重要影響因素.圖3為濃硫酸不同用量對吸光度的影響.結(jié)果表明,吸光度隨濃硫酸用量的增加而不斷提高,但超過5.5 mL后,隨著濃硫酸用量的增加,吸光度反而下降,這可能是因為過量的硫酸導(dǎo)致顯色物質(zhì)的分解.因此,濃硫酸最佳用量為5.5 mL.

    圖3 不同濃硫酸用量對吸光度的影響

    (2)苯酚用量

    不同苯酚用量對吸光度值的影響如圖4所示.結(jié)果表明,吸光度隨著苯酚用量增加而增加,當(dāng)苯酚用量0.9 mL時吸光度最大,0.9 mL之后吸光度值開始減小.該結(jié)果與張居作等人在進行苦瓜多糖苯酚-硫酸法的苯酚用量試驗結(jié)果類似[15].這可能是因為隨著苯酚用量的增加,濃硫酸會搶先跟苯酚反應(yīng),導(dǎo)致與佛手瓜多糖反應(yīng)會減少.因此,苯酚最佳用量為0.9 mL.

    圖4 不同苯酚用量對吸光度的影響

    2.1.4 顯色測定條件的確定

    顯色溫度和時間會直接影響多糖的析出以及顯色反應(yīng)的程度.

    (1)顯色溫度

    圖5為不同顯色溫度對吸光度值的影響.結(jié)果表明,溫度在20~40 ℃之間,吸光度隨著溫度的升高而升高,當(dāng)溫度達到40 ℃時,吸光度最大,大于40 ℃時吸光度開始減小.這可能是因為溫度低顯色反應(yīng)速度變慢,而溫度升高到佛手瓜多糖保護溫度40 ℃及以上,佛手瓜水溶性多糖活性結(jié)構(gòu)又會遭到破壞.因此,最佳顯色溫度為40 ℃.

    (2)顯色時間

    圖5 不同顯色溫度對吸光度的影響

    不同顯色時間對吸光度值的影響如圖6所示.結(jié)果表明,顯色時間5 min時,吸光度最大.當(dāng)顯色時間繼續(xù)增加時,吸光度開始降低,這可能是因為顯色時間過長導(dǎo)致橙色復(fù)合物發(fā)生了分解.因此,最佳顯色時間為5 min.

    圖6 不同顯色時間對吸光度的影響

    2.2 苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖換算因子和多糖含量的計算

    2.2.1 葡萄糖標(biāo)準曲線的繪制

    以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制吸光度-葡萄糖質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線,如圖7所示.結(jié)果表明,線性回歸方程y= 0.016 7x-0.079 0,R2為0.999 1,相關(guān)系數(shù)為0.999 5.線性關(guān)系良好.

    圖7 葡萄糖標(biāo)準曲線

    2.2.2 換算因子和多糖含量的計算結(jié)果

    本試驗利用佛手瓜中的水溶性多糖來計算換算因子,避免了用葡萄糖做標(biāo)準引起的系統(tǒng)誤差,而且因為組成上與待測樣品最接近,結(jié)果會比較接近真實值.為了提高苯酚-硫酸法的準確性,目前多糖含量測定時大多采用校正系數(shù)或換算因子的方法[16].本試驗對3次備用液的吸光度進行了平行測定,吸光度平均值0.576,按公式(1)計算得到換算因子F=2.55.

    試驗中對3次樣品液的吸光度進行平行測定,吸光度的均值為0.436,試驗中對樣品液進行了800倍的稀釋,代入換算因子,按公式(2)計算得到佛手瓜水溶性多糖的含量為0.629 1%.

    2.3 苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖方法學(xué)驗證試驗

    2.3.1 精密度試驗結(jié)果

    為確定試驗的精密度,在上述優(yōu)化后的條件下,對顯色反應(yīng)進行精密度試驗. 5次吸光度測定的結(jié)果分別為0.430,0.442,0.401,0.437,0.428,RSD=3.71%,顯示優(yōu)化后的苯酚-硫酸法精密度良好.

    2.3.2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

    為確定試驗的穩(wěn)定性,在上述優(yōu)化后的條件下,對顯色反應(yīng)進行穩(wěn)定性試驗.顯色液在0.5 h時的吸光度值為0.424,顯色液在3 h時的吸光度值為0.425,穩(wěn)定性試驗中RSD=0.08%,結(jié)果表明,顯色液在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.因此,優(yōu)化后的苯酚-硫酸法穩(wěn)定性良好.

    2.3.3 加樣回收率試驗結(jié)果

    按照樣品測量方法,在上述優(yōu)化后的條件下,對顯色反應(yīng)進行加樣回收率試驗.如表1所示,平均回收率為110.1%,RSD為1.52%.結(jié)果表明,優(yōu)化后的苯酚-硫酸法加樣回收率較高.

    表1 加樣回收率試驗結(jié)果

    3 結(jié)論

    苯酚-硫酸法測定佛手瓜水溶性多糖含量最佳測定條件是:最大吸收波長485 nm;試劑最佳添加順序:多糖溶液,苯酚,濃硫酸;試劑最佳用量:濃硫酸5.5 mL,苯酚0.9 mL;顯色測定最佳條件:溫度40 ℃,顯色時間5 min.回歸方程為y=0.016 7x-0.079 0,相關(guān)系數(shù)為0.999 5.該方法平均回收率110.1%,RSD1.52%,顯色液在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.苯酚-硫酸法是測定佛手瓜中水溶性多糖含量的一種高穩(wěn)定性和高回收率的方法,為將來利用活性物質(zhì)進行佛手瓜的精深加工打下基礎(chǔ),同時具有很高的實際應(yīng)用價值.

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