廣西人群AURKC基因rs1008073和rs2302060位點(diǎn)遺傳多態(tài)性與畸形精子癥的相關(guān)性研究

劉中林，韋玉霞，龐曉霞，廖碧云，陳興鴻，楊鳳蓮，王俊利

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 百色 533000)

不孕不育已成為育齡夫婦的一個(gè)困擾，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有10%～15%的夫婦受到影響，且男性因素占30%～50%[1]。而畸形精子癥是導(dǎo)致男性不育的主要原因之一。近年來國(guó)外的一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，極光激酶C(AURKC)基因的多態(tài)性可能與男性畸形精子癥有關(guān)[2-4]。本研究采用SNaPshot基因分型技術(shù)，對(duì)廣西人群AURKC基因rs1008073和rs2302060位點(diǎn)進(jìn)行分析，探討其與畸形精子癥的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年6月—2019年4月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院男科就診的286例男性患者為研究對(duì)象，所有研究對(duì)象戶籍均為廣西，且近5年內(nèi)常住廣西。分為畸形精子癥組(142例)和對(duì)照組(144例)。畸形精子癥組納入標(biāo)準(zhǔn)為：①患者正常形態(tài)精子百分率<4%，精液質(zhì)量分析正常；②夫妻雙方共同生活超過1年，且性生活正常，在未避孕措施的情況下無法孕育?；尉影Y組排除標(biāo)準(zhǔn)為：①排除有生殖器感染、損傷、精索靜脈曲張等影響精子形態(tài)的疾病[5]；②排除有吸毒、桑拿、嗜煙、酗酒、長(zhǎng)期接觸鋁/輻射/油漆等患者[5-6]。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)為：患者正常形態(tài)精子百分率≥4%，且其他精液相關(guān)檢查正常，有正常生育史、身體健康的生育體檢男性。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除有不良嗜好和不良生活方式的患者，如酗酒、嗜煙、吸毒、長(zhǎng)期熬夜等[5]。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 精液相關(guān)檢查 根據(jù) WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第5版)標(biāo)準(zhǔn)[7]，使用西班牙SCA檢測(cè)精液質(zhì)量，精子形態(tài)學(xué)檢查采用diff-quik染色方法。

1.2.2 全血標(biāo)本采集及DNA提取保存 所有研究對(duì)象給予靜脈穿刺，采集靜脈血3 ml，注入EDTA-K2抗凝管。根據(jù)全血核酸(DNA)提取試劑盒說明書(亞能生物技術(shù)有限公司)提取全基因組DNA(離心柱法)，保存于-20℃，備用。

1.2.3 多重單堿基延伸PCR 基因分型由上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行分型，包括PCR引物合成、多重PCR反應(yīng)、PCR產(chǎn)物純化、延伸產(chǎn)物純化、延伸產(chǎn)物測(cè)序。其中PCR反應(yīng)循環(huán)程序?yàn)椋旱谝徊剑?5℃ 2 min；第二步，94℃ 20 s，65℃ 40 s，72℃延伸60 s，循環(huán)11次；第三步，94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)24次；第四步，72 ℃再延伸2 min。PCR引物、延伸引物設(shè)計(jì)見表1、表2。

表1 rs1008073和rs2302060位點(diǎn)PCR引物

表2 rs1008073和rs2302060位點(diǎn)PCR延伸引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS 22.0軟件，不符合正態(tài)分布的兩組計(jì)量資料間的比較使用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，用M(Q25～Q75)表示。AURKC基因突變對(duì)畸形精子癥的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度使用非條件Logistic統(tǒng)計(jì)分析。哈迪-溫伯格定律檢驗(yàn)基因位點(diǎn)遺傳平衡。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般臨床資料 兩組間的精液質(zhì)量參數(shù)、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而正常形態(tài)精子百分率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表3。

2.2 AURKC基因 rs1008073、rs2302060位點(diǎn)基因分型結(jié)果 AURKC基因 rs1008073、rs2302060位點(diǎn)的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小分別為150bp、114bp。ABI3730XL電泳儀檢測(cè)AURKC基因SNPs分型結(jié)果顯示rs1008073位點(diǎn)存在CC、CG、GG基因型和C、G等位基因。rs2302060位點(diǎn)存在TT、TC、CC基因型和T、C等位基因?；驕y(cè)序可以證實(shí)我們的SNP基因分型結(jié)果，見圖1、圖2。

表3 研究對(duì)象一般資料比較

注：①代表CC；②代表CG；③代表GG。圖1 rs1008073基因型

注：①代表TT；②代表TC；③代表CC。圖2 rs2302060基因型

2.3 AURKC基因rs1008073、rs2302060位點(diǎn)與畸形精子癥的關(guān)聯(lián)性 畸形精子癥組和對(duì)照組之間AURKC基因rs1008073、rs2302060位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布如表4所示。畸形精子癥組基因型分布符合哈迪-溫伯格定律(rs1008073：χ2=1.103，P=0.294；rs2302060：χ2=1.837，P=0.175)。對(duì)照組基因型分布符合哈迪-溫伯格定律(rs1008073：χ2=0.063，P=0.803；rs2302060：χ2=3.330，P=0.995)。兩組兩個(gè)位點(diǎn)基因型經(jīng)哈迪溫伯格平衡定律檢驗(yàn)，P均>0.05，提示這兩組研究對(duì)象群體基因遺傳平衡，具有群體代表性。經(jīng)非條件Logistic回歸分析，rs1008073和rs2302060位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在兩組間差異都無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

2.4 AURKC基因rs1008073、rs2302060位點(diǎn)單倍型分析 使用在線軟件SHEsis對(duì)rs1008073、rs2302060位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡(LD)分析。結(jié)果顯示，rs1008073和rs2302060位點(diǎn)D′=0.992，r2=0.984，說明這2個(gè)SNP之間存在強(qiáng)連鎖不平衡，如圖3所示。根據(jù)SHEsis軟件結(jié)果，AURKC基因rs1008073、rs2302060位點(diǎn)存在CT、GC、CC和GT共4種單倍型，但兩組間這4種單倍型的頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表4 兩組AURKC基因rs1008073、rs2302060 位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率比較

圖3 AURKC基因rs1008073、rs2302060 位點(diǎn)連鎖不平衡分析

3 討論

精子的發(fā)生是一個(gè)極其精密而有序的過程，受到許多因素的影響，如內(nèi)分泌激素和基因，其中任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會(huì)改變精子的生理結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致精子形態(tài)的異常，影響生育能力，其中基因異常導(dǎo)致精子發(fā)生異常最為多見[8-10]。大頭多尾精子癥是畸形精子癥中的一種[11]，與其相關(guān)的主要基因是極光激酶C(AURKC)基因[12]。極光激酶A、B和C蛋白是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)酶，確保在細(xì)胞分裂過程中紡錘體裝置的準(zhǔn)確形成。在精子發(fā)生過程中，AURKC蛋白保證了染色體在減數(shù)分裂和胞質(zhì)分裂過程中的準(zhǔn)確分離[13]。

表5 單倍型在畸形精子癥組和對(duì)照組中的分布

AURKC基因位于人染色體19q13，有7個(gè)外顯子，在人體內(nèi)編碼309個(gè)氨基酸蛋白，到目前為止，已報(bào)道的SNP主要有6個(gè)：c.144delC、c.686G>A、c.744C>G、c.930+38G>A、c.436-2A>G及c.269G>a[14]。其中AURKC.144delC是最常見的大頭精子癥的遺傳原因，約1/10000男性會(huì)有，這一頻率對(duì)于導(dǎo)致生殖缺陷的突變來說非常高[15]。因此，在6個(gè)SNP里，c.144delC的研究也最多，Dieterich K等[2]對(duì)來自北非的10名不育男性進(jìn)行了全基因組微掃描，在Aurora C的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了c.144delC突變，這些男性的精子幾乎是100%的四倍體。Kerch FE等[3]在西非地區(qū)對(duì)18例畸形精子癥患者研究時(shí)，在試驗(yàn)組AURKC基因中檢測(cè)出了純合c.144delC突變。Khelifa MB等[4]在研究歐洲和非洲87例典型大頭多尾精子癥患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組中有85%的患者帶有c.144delC突變。研究表明[16]，c.144delC突變?cè)斐梢粋€(gè)移碼，導(dǎo)致氨基酸49處的亮氨酸到色氨酸密碼子的變化，而移碼后的22個(gè)錯(cuò)義殘基是翻譯終止密碼子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)截短，這種改變使AURKC的催化結(jié)構(gòu)域始于42位，導(dǎo)致激酶結(jié)構(gòu)域幾乎完全丟失，從而降低染色體乘客復(fù)合體(CPC)對(duì)染色體的定位能力，使精原細(xì)胞不能完成減數(shù)分裂I，當(dāng)減數(shù)分裂失敗時(shí)，而精子發(fā)生又未受影響，就會(huì)導(dǎo)致四倍體多個(gè)鞭毛精子的形成。目前，國(guó)內(nèi)有1例該問題的研究報(bào)道：穆雪梅等[17]在四川地區(qū)研究AURKC基因c.144delC位點(diǎn)與男性不育的相關(guān)性時(shí)，未能在AURKC基因中檢出 c.144delC突變。這可能是基因多態(tài)性具有地域、種族差異導(dǎo)致的結(jié)果，也有可能是由于樣本量少、實(shí)驗(yàn)條件有限、各種風(fēng)險(xiǎn)因素資料缺乏等關(guān)系引起。本次研究的rs1008073和rs2302060位點(diǎn)也與畸形精子癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性，因此這2個(gè)位點(diǎn)不能作為畸形精子癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分子遺傳標(biāo)記。

綜上所述，AURKC基因多態(tài)性與男性畸形精子癥的研究在國(guó)外男性群體發(fā)現(xiàn)不同研究結(jié)論，但在我國(guó)僅有少數(shù)研究，且多為單一國(guó)外人群陽性位點(diǎn)的驗(yàn)證。本次研究的2個(gè)位點(diǎn)與畸形精子癥無相關(guān)性，所以下一步我們需要尋找更多、更適合的位點(diǎn)進(jìn)行深入研究，提高實(shí)驗(yàn)條件，收集更多的樣本，提高結(jié)論的可靠性。