山黃皮不同部位水提取物抗菌和降糖作用分析

廖麗娟，黃已桃，戴園園，李如佳，覃春，李曉華，吳標良，黃衍強，黃永毅

(右江民族醫(yī)學院耐藥微生物感染防治研究中心，廣西 百色 533000)

山黃皮，又稱雞皮果、野黃皮、假黃皮，是蕓香科植物，屬于亞熱帶珍稀野生植物，是一種具有特殊香味的水果，主要分布在桂西南石山地區(qū)，以廣西龍州縣分布最多[1]。山黃皮果實富含多種氨基酸和礦物質(zhì)，具有祛濕、消炎、消暑、化滯、健脾健胃的功效，可鮮食、調(diào)味、入藥，具有很大的藥用價值，我國民間常用于治療上感、瘧疾、高血糖、腹痛及胃炎等癥狀，其粗提物藥理活性廣泛[2]，但其不同部位、不同的提取方法，其降糖效果可能不同，抗菌作用的抗菌譜也會有很大的差異。近年來，從植物中篩選、分離和純化生物活性成分是研發(fā)新藥的有效途徑[3]。本文旨在研究山黃皮果皮和果核水提物的抗菌作用和降血糖作用，以期明確山黃皮水提物最佳藥效部位，為后續(xù)研發(fā)山黃皮藥用價值提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 在廣西龍州縣采集新鮮的山黃皮果皮與果核(Clausena indica)，并經(jīng)過右江民族醫(yī)學院生藥學劉春榮老師鑒定為蕓香科植物黃皮樹的果實。

1.1.2 儀器 電子天平、搗藥罐、鋁鍋、冰箱、真空干燥機、滅菌鍋、干燥箱、離心機、恒溫培養(yǎng)箱、紫外分光光度計、超凈工作臺、濾菌器、灌胃針、注射器、血糖儀、血糖試紙等。

1.1.3 試驗菌種 枯草芽孢桿菌、鮑曼不動桿菌(敏感)、霍氏腸桿菌、摩氏摩根菌、白色念球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(敏感)、溶血葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌。所有菌種均由右江民族醫(yī)學院耐藥微生物感染防治研究中心提供。

1.1.4 試劑 MH培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、肉湯液體培養(yǎng)基、檸檬酸、檸檬酸三鈉、鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ) 、二甲雙胍、生理鹽水、酒精等。

1.1.5 動物 SPF級C57BL/6小鼠，雄性，4～5周齡，30只，體重17～22 g。購于長沙天勤生物技術(shù)有限公司。動物許可證號：SCXK(湘)2019-0014。

1.2 方法

1.2.1 山黃皮抑菌試驗

1.2.1.1 山黃皮果皮、果核活性成分物質(zhì)提取制備 參考徐紹成等[4]方法，山黃皮去梗、去果肉，分離果皮與果核，用銅沖分別搗碎果皮、果核，準確稱量得果皮104 g，果核201 g。山黃皮果皮取104 g，加水沒過果皮浸泡30 min，煎煮3次，第1次、第2次煮1 h，第3次煮30 min，其間需加水補充蒸發(fā)的水分，使用玻璃棒攪動，避免糊底，每次煎煮完成后，過濾，得濾液，再加適量水重新煎煮。合并3次濾液，濃縮，真空干燥，干燥完成后放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。果核的提取方法同上?/p>

1.2.1.2 含藥培養(yǎng)基的制備 根據(jù)培養(yǎng)基配制說明書，配制MH培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、肉湯液體培養(yǎng)基，置于滅菌鍋中滅菌。固體培養(yǎng)基滅菌完成后置于干燥箱中，待冷卻至60℃取出培養(yǎng)基，準確稱量山黃皮果皮、果核提取物的重量，將藥物加入已滅菌固體培養(yǎng)基中，設置100 mg/ml、10 mg/ml、1 mg/ml、0.1 mg/ml 4個濃度的含藥培養(yǎng)基，待藥物完全溶解后，傾注平板，含藥培養(yǎng)基制備完成。為確認培養(yǎng)基是否污染，將制成的培養(yǎng)基隨機抽取1個置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，作無菌試驗，觀察結(jié)果。

1.2.1.3 菌懸液的制備 采用麥氏比濁法測量各受試菌株的濃度，受試菌株經(jīng)復蘇活化、培養(yǎng)后，用肉湯液體培養(yǎng)基制備成濃度相當于0.3麥氏標準比濁管的菌懸液，菌液濃度相當于1×108CFU/ ml，再稀釋為1×106CFU/ ml，其中白色念球菌需制備成濃度相當于0.5麥氏標準比濁管的菌懸液，菌液濃度相當于0.5×106CFU/ ml，再稀釋為0.5×103CFU/ ml，菌懸液制備完成。

1.2.1.4 抑菌實驗方法 在含藥培養(yǎng)基背面劃分區(qū)域，并注明受試菌名，用微量移液器取各受試菌菌懸液1 μl，接種到相應的區(qū)域內(nèi)，滴3次，形成直徑為3～5 mm的菌斑。其他細菌菌液同上，同時將相應劑量的液體培養(yǎng)基接種于含藥培養(yǎng)基中作為陰性對照，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24～48 h，將培養(yǎng)基置于暗色、不反光的物體表面上觀察實驗結(jié)果，判斷實驗終點，MIC為抑制細菌生長的最低藥物濃度。實驗重復3次，取平均結(jié)果。

1.2.2 山黃皮降血糖試驗

1.2.2.1 藥材與藥物成分提取濃度的制備試驗 選用山黃皮果皮為藥物提取原料，提取方法同上。將提取物溶于無菌的UP水中，分別配制成200 mg/ml和50 mg/ml 2個藥物濃度，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 STZ溶液的配制 準確稱量2.10 g 檸檬酸和2.94 g檸檬酸三鈉分別加入100 ml雙蒸水中配成檸檬酸母液的A液和B液；將A、B液按1∶1.32比例混合，測量pH值，調(diào)定溶液pH=4.0，即配制好的0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液。將STZ溶于檸檬酸鈉緩沖液中，制備濃度為12 mg/ml的STZ溶液，并用0.22 μm濾菌器過濾除菌。配制過程中需嚴格避光，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2.3 建造糖尿病模型組 參考其他學者研究方法[5-6]，造模前12 h 禁食，模型組小鼠腹腔注射STZ，對照組小鼠注射等量檸檬酸鈉緩沖液。STZ注射0.15 ml/10 g小鼠，給藥1次/天，連續(xù)2 d后，測定空腹血糖，選擇空腹血糖高于11.1 mmol/L的小鼠納入正式實驗。

1.2.2.4 動物分組及給藥 實驗動物分正常對照組、病理模型組、陽性藥組、受試藥山黃皮200 mg/ml和50 mg/ml兩個劑量組。正常對照組6只，灌胃生理鹽水；挑選糖尿病模型組24只，分4組，平均每組6只，即病理模型組，灌胃生理鹽水；陽性藥組，灌胃二甲雙胍；受試藥山黃皮200 mg/ml和50 mg/ml兩個劑量組，分別灌胃不同濃度的山黃皮成分提取物；灌胃給藥體積為每只0.4 ml，連續(xù)給藥15 d。每日進行藥物治療，除了測血糖當天禁食不禁水8 h之外，其余時間正常供給食物和水，每隔3 d稱重和剪尾采血用血糖儀檢測1次空腹血糖值，并記錄小鼠體重和血糖的變化。每次灌胃前，待藥物恢復至室溫、搖勻，使用干凈的灌胃針灌胃，同時給藥治療過程中觀察記錄小鼠的狀態(tài)并及時清理鼠籠，保持實驗小鼠的良好居住環(huán)境。

2 結(jié)果

2.1 山黃皮抑菌結(jié)果 培養(yǎng)24～48 h后，對照陰性對照無菌落生長，可證明試驗結(jié)果有效。本試驗中不同濃度的山黃皮果皮和果核均有一定的抑菌效果，其中在試驗范圍內(nèi)山黃皮果皮對各受試菌的最低抑菌濃度(MIC)均為100 mg/ml。而山黃皮果核對各受試菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為：枯草芽孢桿菌、鮑曼不動桿菌(敏感)、霍氏腸桿菌、摩氏摩根菌、白色念球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(敏感)、溶血葡萄球菌和銅綠假單胞菌均為100 mg/ml；肺炎克雷伯菌>100 mg/ml，說明山黃皮果皮成分提取物抑菌譜更寬，而山黃皮果核抑菌譜較窄。見表1。

表1 山黃皮果皮和果核對各受試菌的抑菌濃度結(jié)果

2.2 山黃皮果皮降血糖試驗結(jié)果

2.2.1 試驗小鼠生長狀況 正常對照組小鼠生長狀況良好，無任何異常；模型組小鼠毛發(fā)稀疏，光澤度低，飲水多，嗜睡，活躍度低，無足潰爛情況，小鼠的糞便較多且有特殊臭味；陽性藥組小鼠毛發(fā)光澤度較高，山黃皮200 mg/ml劑量組毛發(fā)光澤度較模型組有改善，山黃皮50 mg/ml劑量組無明顯變化。

2.2.2 試驗小鼠體重變化對比 在給藥過程中，正常對照組小鼠體重隨著給藥時間的增加而緩慢升高。與正常對照組對比，第6天、9天、12天、15天病理模型組的小鼠體重下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與病理模型組對比，陽性藥組小鼠體重升高，山黃皮果皮50 mg/ml劑量組小鼠體重呈上升變化，200 mg/ml劑量組也增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2及圖1。

表2 各組小鼠體重變化 單位：g

圖1 各組小鼠體重變化

2.2.3 試驗小鼠血糖變化 病理模型組與正常對照組相比，病理模型組血糖水平始終高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與病理模型組相比，陽性藥組血糖水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；山黃皮果皮50 mg/ml劑量組血糖水平有下降的趨勢，200 mg/ml劑量組血糖水平也下降，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3及圖2。

圖2 各組小鼠血糖值變化

3 討論

本研究采用傳統(tǒng)的水提法提取山黃皮果皮和果核的成分，用于10種常見菌的抑菌試驗檢測出濃度為100 mg/ml的水提取物抑菌效果最佳。試驗結(jié)果初步表明，山黃皮果皮和果核水提取物均具有一定的抑菌作用。對比趙豐麗等[7]研究以黃皮葉為提取材料并發(fā)現(xiàn)黃皮葉具有明顯的抑菌效果，本研究中選用果皮和果核也證明具有抑菌的作用，表明山黃皮具有更大的藥用價值和廣泛的藥理活性；另有研究[7]用乙醇、石油醚和水三種溶劑進行黃皮葉活性成分的提取，結(jié)果顯示黃皮葉乙醇提取物抑菌效果最佳，水提物無明顯效果，而本研究中則證明果皮和果核水提物同樣具備一定的抑菌作用。本研究與其他學者[7]的研究對比，本研究的特色在于擴大了抗菌譜檢測，發(fā)現(xiàn)山黃皮不僅對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(敏感)具有抑菌作用，而且對霍氏腸桿菌、銅綠假單胞菌、摩氏摩根菌、溶血葡萄球菌、白色念球菌、鮑曼不動桿菌(敏感)、肺炎克雷伯菌等常見菌也有抑菌作用，而且表明山黃皮果皮水提物具有更寬的抗菌譜，山黃皮果皮部位提取物可能更適合應用在食品的保鮮和防腐等方面。

山黃皮果皮降血糖作用的試驗，結(jié)果表明注射二甲雙胍的陽性藥組降血糖效果最顯著，對比山黃皮果皮200 mg/ml和50 mg/ml劑量組，山黃皮果皮200 mg/ml劑量組雖然體重有升高趨勢、血糖有明顯下降的趨勢，但是沒有統(tǒng)計學意義。對比黃小桃等[8]研究黃皮葉水提物對STZ誘導的糖尿病大鼠的作用及其機制：黃皮葉可降低糖尿病大鼠的空腹血糖和餐后血糖值，修復和促進大鼠胰島細胞的增殖生長，使得胰島細胞數(shù)量增多，改善胰島細胞受損的功能，使葡萄糖的利用率提高，降低高血糖狀況。本次試驗中山黃皮果皮水提物并沒有達到顯著的降血糖作用，可能的原因：①山黃皮降血糖的主要活性成分并不在果皮中，而在山黃皮葉等其它部位；②設置給藥濃度的差異，可能是給藥劑量不足，導致小鼠降血糖作用不明顯；③給藥時間和周期的差異，黃小桃等[8]試驗中以每天給藥1次，連續(xù)5周的給藥方式，每周采血觀察血糖值變化，本試驗中僅連續(xù)給藥15 d，每3 d采血觀察血糖值變化；④本研究用的實驗動物是小鼠，而其他學者是用大鼠，兩者之間可能也存在一定的差異。

本研究分析了山黃皮果皮和果核水提物的抗菌作用和降糖作用，拓展了山黃皮的抗菌譜，明確了山黃皮果皮部位抗菌效果更佳。本研究并未涉及其山黃皮單體有效成分的提取和活性分析，有研究報道，從黃皮葉中可分離出具備明顯降血糖作用的香豆精類等天然化合物[9-10]，后續(xù)研究我們將根據(jù)前人報道和結(jié)合本實驗結(jié)果，注重從山黃皮果皮和山黃皮葉部位分別提取活性成分，分別探索其抑菌和降血糖作用，以及對活性單體進行改造和修飾，為提高山黃皮抑菌和降血糖藥用價值提供參考。