抗幽門螺桿菌的澤蘭有效成分篩選

黃永毅，李如佳，黃干榮，覃艷春，李曉華，黃衍強，羅顯克

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院耐藥微生物感染防治研究中心，廣西 百色 533000；2. 廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 南寧 530001)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp) 是牙周炎、胃炎、消化性潰瘍和胃癌等多種疾病的重要病因[1]。Hp感染人數(shù)超過全球約50%以上的人口[2]，目前主要采用抗生素進(jìn)行治療，但隨著抗生素的廣泛使用和濫用，Hp耐藥率逐年遞增，急需新的藥物用于治療[3]。從天然產(chǎn)物如植物、中藥中篩選活性成分是研發(fā)新型藥物比較快速、有效的方法[4]。我國一些傳統(tǒng)中藥具有良好的抑菌效果，不易產(chǎn)生耐藥，且安全性高，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用[5]。澤蘭(Eupatorium japonicum Thunb.)是我國傳統(tǒng)的中藥材，具有清熱解毒，祛瘀消癰等功效，澤蘭中的一些萜類、苯并呋喃類[6]、黃酮類成分，具有明顯的抑菌效果[7]。從澤蘭中篩選出抗菌效果良好、成藥性高的先導(dǎo)物頗具研究前景，但目前有關(guān)澤蘭中抗Hp及其有效成分的研究尚未見報道。為此，本文主要以Hp為供試菌，篩選澤蘭中抗Hp的有效成分，以期為澤蘭有效成分作為先導(dǎo)化合物的研發(fā)等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥澤蘭購自中藥材誠實通平臺、澤蘭黃酮(CAS號：520-11-6)、半齒澤蘭素(CAS號：855-96-9)、異澤蘭黃素(CAS號：22368-21-4)購自成都瑞芬思生物科技有限公司，BactoTM Brain Heart infusion(BHI)培養(yǎng)基、哥倫Columbia blood Agar base(G)培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)小牛血清、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自南京晶格化學(xué)科技有限公司，Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株由南京醫(yī)科大學(xué)畢洪凱實驗室贈送，Hp臨床分離菌株為本實驗室分離獲得。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂稀釋法檢測澤蘭水提物最小抑菌濃度(MIC90) ①水提物制備：中藥澤蘭準(zhǔn)確稱量重量。加水沒過澤蘭浸泡30 min，煎煮3次，第1次煮1 h，第2次煮45 min，第3次煮30 min。其間不斷加水補充蒸發(fā)的水分，使用玻璃棒攪拌，避免糊底，每次煎煮完成后，過濾，得濾液，再加適量水重新煎煮。合并3次濾液，濃縮，真空干燥，干燥完成后放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＂诃傊逯苽洌簩⒉煌瑵舛鹊目咕幬锓謩e加入50 ml燒瓶，使培養(yǎng)基和藥物混合后含藥量分別是100 mg/ml、10 mg/ml、1 mg/ml、0.1mg/ml，藥物和培養(yǎng)基總量為20 ml。③菌液制備及接種：取固體平板上對數(shù)期生長的菌用對應(yīng)培養(yǎng)基制作成菌懸液，Hp調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/ml(OD600為0.3)，備用；其余細(xì)菌調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/ml(OD600為0.3)，稀釋10倍，備用；真菌調(diào)整菌液濃度為5×106CFU/ml(OD600為0.5)，稀釋100倍，備用。取1 μl接種于瓊脂表面，每點菌數(shù)約為Hp為105CFU/ml，其余細(xì)菌為104CFU/ml，真菌為5×102CFU/ml。并取1 μl菌液接種于菌株原培養(yǎng)基作陽性對照，含藥液的瓊脂板作陰性對照。接種好放置相應(yīng)培養(yǎng)箱孵育。④判斷結(jié)果：當(dāng)含藥物未加菌的陰性對照板上細(xì)菌無生長和菌株原培養(yǎng)基陽性板上有菌生長實驗才有意義。將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗終點，以抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。在孔瓊脂表面上可見輕微細(xì)菌生長，與生長對照比較抑制80%以上細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為終點濃度。如果出現(xiàn)有2個以上菌落生長于含藥濃度高于終點水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平板上不長而高濃度藥物瓊脂平板上生長現(xiàn)象，則應(yīng)檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗。

1.2.2 微量稀釋法檢測有效成分最小抑菌濃度(MIC90) ①抗菌藥物制備：抗菌藥物貯存液濃度4000 μg/ml。②96孔板制備：第1孔先加培養(yǎng)基173.6 μl，其它各孔加培養(yǎng)基90 μl，第1孔再加6.4 μl抗菌藥物，按倍稀釋至第11孔；第12孔作為加菌不加藥對照，保留90 μl培養(yǎng)基。③菌液制備：取固體平板上對數(shù)期生長的菌用對應(yīng)培養(yǎng)基制作成菌懸液，Hp調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/ml(OD600為0.3)，稀釋10倍，備用；其余細(xì)菌調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/ml(OD600為0.3)，稀釋100倍，備用；真菌調(diào)整菌液濃度為5×106CFU/ml(OD600為0.5)，稀釋1000倍，備用。④接種菌液：取上述備用菌液10 μl加至第1～10孔和第12孔(Hp工作濃度為1×106CFU/ml，其余細(xì)菌工作濃度為1×105CFU/ml，真菌工作濃度為5×102CFU/ml)，第11孔作為不加菌對照，只加無菌水。培養(yǎng)72 h判斷結(jié)果。1～10孔藥物濃度分別為128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml。⑤判斷結(jié)果：當(dāng)不含菌的陰性對照孔(即第11孔)內(nèi)細(xì)菌無生長和有菌無藥物陽性孔 (第12孔)有菌生長實驗才有意義。以完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為MIC。如果出現(xiàn)單一的跳孔時，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長的最高藥物濃度，如果出現(xiàn)多處跳孔，則該次結(jié)果作廢，結(jié)果重復(fù)3次。

1.2.3 瓊脂稀釋法檢測有效成分最小抑菌濃度(MIC90) ①瓊脂板制備：將已倍比稀釋的不同濃度的抗菌藥物分別加入50 ml燒瓶，對應(yīng)培養(yǎng)基在50～55℃恒溫器中保持液態(tài)，按比例加入培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基和藥物混合后含藥量分別是128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml，藥物和培養(yǎng)基總量為10 ml。②菌液制備及接種，同1.2.1。③判斷結(jié)果，同1.2.1。

2 結(jié)果

2.1 澤蘭水提物抑菌效果 用瓊脂稀釋法檢測澤蘭水提物最小抑菌濃度，如表1所示。發(fā)現(xiàn)澤蘭水提物對金黃色葡萄球菌、幽門螺桿菌抑菌效果良好，MIC為1 mg/ml。對鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠球菌、銅綠假單胞菌也有抑制效果，MIC為10 mg/ml。

表1 澤蘭水提物抑菌效果

2.2 澤蘭有效成分篩選結(jié)果 購買的3種澤蘭中主要抑菌成分對兩種Hp供試菌的MIC值，如表2所示。由表中MIC可知，異澤蘭黃素、澤蘭黃酮對Hp敏感或耐藥菌株均有很好的抑制效果，MIC值為16 μg/ml。半齒澤蘭素對Hp菌株未見明顯抑菌效果，MIC>128 μg/ml。抑菌效果判斷標(biāo)準(zhǔn)為有效成分抑菌濃度是否小于水提物抑菌濃度。

表2 澤蘭中主要成分對Hp的MIC檢測 單位：μg/ml

2.3 澤蘭成分對18種Hp菌株MIC檢測結(jié)果 異澤蘭黃素、澤蘭黃酮對18種Hp供試菌藥敏MIC檢測結(jié)果，如表3所示。瓊脂稀釋法驗證MIC檢測結(jié)果，如圖1所示，異澤蘭黃素和澤蘭黃酮對敏感、耐藥和多重耐藥Hp菌株均有良好的抑菌效果，MIC值16～64 μg/ml。

3 討論

隨著抗生素的廣泛使用和濫用，使得Hp耐藥性逐年遞增，且抗生素的不良反應(yīng)越來越突出。因此，探索新型藥物用于治療是非常急迫的任務(wù)。本研究發(fā)現(xiàn)，澤蘭水提物對銅綠假單胞菌、白色念珠球菌等菌株具有不同程度的抑制作用，對Hp抑制效果更為明顯。池水晶等[8]采用不同試劑粗提澤蘭，發(fā)現(xiàn)澤蘭的提取物對金黃色葡萄球菌、白色念珠球菌等具有明顯的抑制效果。陳芝蕓等[9]篩選100種中藥發(fā)現(xiàn)澤蘭對Hp具有很好的抑制效果。這些與我們的研究結(jié)果是一致的，但目前澤蘭中具體抑制Hp的有效成分尚未見報道。

表3 澤蘭成分對18種Hp菌株MIC檢測 單位：μg/ml

注：3個培養(yǎng)基從左至右藥物濃度分別為64 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml。圖1 不同濃度藥物對Hp菌株抑制作用檢測

本文為深入研究澤蘭的抑菌效果，購買了3種澤蘭中的有效成分，篩選出了澤蘭中主要抑制Hp的有效成分異澤蘭黃素和澤蘭黃酮。異澤蘭黃素和澤蘭黃酮對敏感和耐藥的Hp菌株均有較好的抑制效果，MIC值16～64 μg/ml，優(yōu)于水提物的抑菌效果?，F(xiàn)代研究表明，異澤蘭黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[10]，對一些酶也存在強烈的抑制作用[11]，但對其抑菌活性研究甚少。張菲等[12]發(fā)現(xiàn)包含澤蘭黃酮成分的谷精草乙醇提取物對革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌均有較好的抑制作用，但未見抑制Hp的相關(guān)報道。本研究盡管篩選出了澤蘭中主要抑制Hp的有效成分，但目前還僅限于體外實驗，如果能進(jìn)行體內(nèi)實驗驗證并掌握其抗菌機制，進(jìn)一步提高其藥效和安全性，那么將是非常理想的新型抗Hp先導(dǎo)化合物。

綜上所述，澤蘭水提物對Hp具有較好的抑制效果，澤蘭中的異澤蘭黃素和澤蘭黃酮對敏感和耐藥的Hp菌株均有較好的抑制效果，是澤蘭的主要抗菌成分。