冰片對血腦屏障通透性影響機(jī)制的研究進(jìn)展

張英睿,王 建,董泰瑋,陳 念,胡瓊丹,樊亞梅

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,四川 成都 611137)

冰片商品有3 種,分別是龍腦香科植物龍腦香Dipterocarpus turbinatus Gaertn.f.樹脂的加工品,即天然冰片；源于菊科植物艾納香Blumea balsamifera (L.) DC.葉提取的結(jié)晶,即艾片；以樟腦、松節(jié)油等為原料,經(jīng)化學(xué)方法合成的精制品[1],即合成冰片,均收載于2020 版《中國藥典》,其味辛、苦,性微寒或涼,有開竅醒腦、清熱止痛之效[2],冰片常作為佐藥以引藥上行。冰片芳香走竄,能開啟閉阻心竅,因心主神明,腦為元神之府,心與腦息息相關(guān)[3],故其配伍應(yīng)用在心腦血管病治療中尤為廣泛。

血腦屏障是彼此緊密相連的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,與周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞相互作用形成的屏障系統(tǒng),結(jié)構(gòu)[4]見圖1。其中,腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接是大分子物質(zhì)經(jīng)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的屏障[4],可選擇性允許所需營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入屏障,阻止某些大分子物質(zhì)進(jìn)入腦組織,從而保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定,但這也限制了大多數(shù)藥物到達(dá)患處并發(fā)揮治療作用,成為藥物治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要制約因素[5]。

現(xiàn)代藥理研究表明[6],冰片可增加生理性血腦屏障通透性,促使其他藥物通過其而引藥上行,同時也可降低已損傷腦組織的血腦屏障通透性,起到保護(hù)腦缺血再灌注后其結(jié)構(gòu)的作用[7]。由此可見,冰片可發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)血腦屏障通透性的作用。

汪宏錦等[8]研究表明,天然冰片、艾片、合成冰片主要成分(分別為右旋龍腦、左旋龍腦、異龍腦) 對血腦屏障通透性的作用方向一致,并且其劑量不同,影響血腦屏障通透性的作用強(qiáng)度也有所差異。冰片對血腦屏障通透性作用方向的影響因素主要有2 點(diǎn),分別為腦組織的生理病理狀態(tài)、冰片的臨床用法(單用或配伍),以下將對其進(jìn)行概述。

圖1 血腦屏障結(jié)構(gòu)示意圖

1 冰片對生理狀態(tài)血腦屏障通透性的影響

1.1 增加生理性血腦屏障通透性 冰片不僅具有開竅醒神的功效,而且性善走竄,引藥上行。王寧生等[9]應(yīng)用CT動態(tài)掃描技術(shù),首次提出冰片引藥上行、佐使有功等作用的發(fā)揮可能與其能增加生理性血腦屏障通透性有關(guān)；現(xiàn)代藥理研究顯示[10],冰片可促進(jìn)生理性血腦屏障開放,而且不會引起腦的病理性損害,并對腦及血腦屏障有一定的保護(hù)作用。

1.1.1 單用促透增量 李偉榮等[11]發(fā)現(xiàn),小鼠灌服天然冰片5 min 后腦內(nèi)即可測得其所含成分含有量,表明灌胃給藥后它自身可直接透過血腦屏障迅速入腦,發(fā)揮促透作用。Wu 等[12]報道,相較于對照組(灌胃給予生理鹽水),灌胃給予等量天然冰片后小鼠腦內(nèi)尼莫地平含有量顯著升高,AUC5～60min提高30%,提示冰片可促進(jìn)生理性血腦屏障開放,引藥上行。俞浩等[13]研究表明,小鼠尾靜脈注射羅丹明123(Rh123) 5 min 后,合成冰片高劑量組(200 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg) 與溶劑對照組相比腦組織內(nèi)該染料含有量顯著升高,同時低劑量組(50 mg/kg) 也有升高趨勢,表明冰片增加血腦屏障通透性作用與其劑量呈正相關(guān)。

1.1.2 配伍促透他藥 陳振振等[14]發(fā)現(xiàn),艾片配伍各劑量麝香酮均可提高血腦屏障體外模型的細(xì)胞膜流動性,降低細(xì)胞膜電位,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含有量,從而促進(jìn)梔子苷進(jìn)入腦部,表明兩者配伍具有芳香開竅的作用,可促進(jìn)生理性血腦屏障開放。黃萍等[15]報道,合成冰片與安息香配伍時可顯著增加小鼠腦組織中伊文思藍(lán)(EB) 含有量,增強(qiáng)開竅醒神的功效。陳群[16]研究表明,低劑量合成冰片(300 mg/kg) 與丹皮酚聯(lián)用后小鼠腦組織中后者含有量高于高劑量冰片(600 mg/kg) 聯(lián)用合用組,與俞浩等[13]結(jié)論相悖,具體有待進(jìn)一步研究。

1.2 機(jī)制研究

1.2.1 增加NO 水平 NO 作為擴(kuò)血管因子之一,可改善局部神經(jīng)元的氧供應(yīng)和微循環(huán),調(diào)節(jié)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性[17],舒張腦血管,是影響血腦屏障通透性的信使分子,通常相關(guān)研究是通過考察一氧化氮合酶(NOS) 間接進(jìn)行的,其中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS) 在生理?xiàng)l件下存在并發(fā)揮生理效應(yīng)。趙保勝等[18]研究表明,合成冰片可誘導(dǎo)eNOS 表達(dá)增強(qiáng),促使腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成更多的NO,從而介導(dǎo)血腦屏障開放。

1.2.2 影響組胺水平 組胺是一類具有廣泛生物活性的單胺類神經(jīng)遞質(zhì),同時也是機(jī)體重要的信息傳遞物質(zhì),存在于神經(jīng)元及組胺能神經(jīng)纖維中,腦內(nèi)其水平升高時可增加血腦屏障通透性。Li 等[19]發(fā)現(xiàn),合成冰片可升高大鼠下丘腦內(nèi)組胺水平,從而介導(dǎo)血腦屏障開放,但該作用具有一定飽和性。曹陽[20]報道,相較于空白組、伊立替康單用組,不同劑量合成冰片聯(lián)用伊立替康后大鼠腦內(nèi)組胺水平均明顯上升,血腦屏障通透性增加。研究表明,組胺誘發(fā)血腦屏障通透性增加由NO 介導(dǎo),這也是生理狀態(tài)下它調(diào)節(jié)微血管通透性的機(jī)制之一[21-22],具體見圖2。

圖2 組胺與NO 的關(guān)系

1.2.3 抑制P-糖蛋白表達(dá) P-糖蛋白是具有藥物外排泵功能的糖蛋白,在血腦屏障處主要分布于腦毛細(xì)血管膜的腔面上,其外排作用對藥物的腦部轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要意義,可單向?qū)⑻囟ㄋ幬锱懦龅侥X微血管腔內(nèi),阻止其向中樞分布,發(fā)揮屏障作用[23]。若同時存在2 種親和力不同的底物,則均可與P-糖蛋白發(fā)生競爭性結(jié)合,而且親和力大者易與其結(jié)合而被泵出細(xì)胞膜外,親和力小者則易在細(xì)胞內(nèi)蓄積[24]。

陳振興[25]應(yīng)用細(xì)胞流式儀和蛋白質(zhì)免疫印跡法,對P-糖蛋白表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性等方面進(jìn)行機(jī)制研究,發(fā)現(xiàn)天然冰片、艾片、合成冰片均能影響其表達(dá),抑制其轉(zhuǎn)運(yùn)活性,而且艾片作用更強(qiáng)。朱國棟[26]研究表明,合成冰片不能抑制大鼠腦組織中P-糖蛋白表達(dá),但其作用與相關(guān)競爭性抑制劑維拉帕米相似,推測冰片可能發(fā)揮競爭性抑制作用而優(yōu)先與P-糖蛋白結(jié)合,從而抑制不易于透過血腦屏障的藥物外排而在細(xì)胞內(nèi)聚集,介導(dǎo)血腦屏障開放[27]。

1.2.4 影響5-羥色胺水平 5-羥色胺是重要的血管活性物質(zhì),也是中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì),其水平變化對血腦屏障通透性有重要影響。Li 等[19]發(fā)現(xiàn),合成冰片可通過升高大鼠下丘腦5-羥色胺來介導(dǎo)血腦屏障開放,而且其作用持久性與劑量有關(guān)。王剛等[28]報道,帕羅西汀聯(lián)合槲皮素組與合成冰片聯(lián)合槲皮素組的作用效果有明顯差異,表明帕羅西汀作為5-羥色胺抑制劑能顯著抑制槲皮素透過血腦屏障,而合成冰片可通過升高大鼠下丘腦5-羥色胺水平可促使血腦屏障開放,從而促進(jìn)槲皮素透過血腦屏障,使腦組織中其水平顯著增加。

但冰片升高5-羥色胺水平的具體機(jī)制尚不明確。有研究表明,5-羥色胺拮抗劑是研究P-糖蛋白功能的有力工具[29],故推測冰片升高其水平的機(jī)制可能與P-糖蛋白有關(guān)。冰片相較于5-羥色胺,對P-糖蛋白的親和力更大,與后者結(jié)合后被泵出細(xì)胞外,抑制了兩者結(jié)合后外排,使5-羥色胺在細(xì)胞內(nèi)蓄積,從而介導(dǎo)血腦屏障開放[24,30]。

1.2.5 改變血腦屏障超微結(jié)構(gòu) 血腦屏障通透性升高時,常表現(xiàn)為血腦屏障緊密連接的開放、基底膜的疏松斷裂、內(nèi)皮細(xì)胞的間隙加大。陳怡君[31]通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn),天然冰片可致血腦屏障超微結(jié)構(gòu)疏松,從而增加血腦屏障通透性。葛朝莉等[24]在透射電鏡下發(fā)現(xiàn)與對照組比較,合成冰片組大鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接縫隙變寬,結(jié)構(gòu)減少,提示冰片可使血腦屏障超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,介導(dǎo)血腦屏障開放。

Claudin-5 蛋白是血腦屏障緊密連接膜蛋白,僅需其表達(dá)即可形成緊密連接,對維持血腦屏障的正常形態(tài)與功能意義重大。Jin 等[32]發(fā)現(xiàn),灌胃給予合成冰片30 min 后,Claudin-5 蛋白從腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì),緊密連接結(jié)構(gòu)也隨之改變,揭示了冰片改變血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的機(jī)制之一。

2 冰片對病理狀態(tài)血腦屏障通透性的影響

2.1 可降低病理性血腦屏障通透性 研究表明,血腦屏障破壞是腦缺血、腦梗塞等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要病理基礎(chǔ)[4]。在病理狀態(tài)下,腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生損傷,前者緊密連接開放,后者足端腫脹[33],血腦屏障通透性顯著增加,導(dǎo)致某些大分子物質(zhì)可通過血腦屏障,而冰片可降低血腦屏障通透性,恢復(fù)其正常功能,從而起到修復(fù)腦損傷、保護(hù)腦組織的作用。

2.1.1 單用 文靜[34]發(fā)現(xiàn),天然冰片、合成冰片可改善永久性大腦中動脈栓塞(pMCAO) 模型大鼠的腦毛細(xì)血管超微形態(tài)結(jié)構(gòu),與假手術(shù)組相似,表明兩者對受損神經(jīng)元及血腦屏障結(jié)構(gòu)具有一定的修復(fù)作用。田徽[35]報道,艾片、合成冰片中的龍腦可迅速透過局灶性腦缺血(MCAO)大鼠血腦屏障,改善其緊密連接的破壞程度,從而降低其通透性以發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,同時證實(shí)艾片透過率略高于合成冰片,而且其療效有優(yōu)于同劑量合成冰片的趨勢。

2.1.2 配伍 徐露等[36]研究天然冰片配伍燈盞花素后腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性的影響,發(fā)現(xiàn)與模型組比較,兩者配伍后伊文思藍(lán)含有量顯著降低,表明血腦屏障通透性降低,從而得到了保護(hù)。楊筱倩[37]等報道,艾片配伍黃芪甲苷、三七總皂苷后,相較于單用可增強(qiáng)對大鼠腦缺血再灌注后腦組織的保護(hù)作用。姚洪武等[38]考察了合成冰片、麝香及其兩者不同配比對缺血性模型小鼠血腦屏障通透性的影響,發(fā)現(xiàn)與模型組相比,冰片-麝香2∶1、3∶1配伍組腦內(nèi)伊文思藍(lán)含有量顯著降低,以前者更明顯,提示兩者合理配伍能降低腦缺血狀態(tài)下血腦屏障通透性。

另外,以麝香、冰片為主的復(fù)方麝香注射液有腦保護(hù)作用,兩者配伍可通過降低腦含水量、血腦屏障通透性來保護(hù)腦組織免受損傷[39]。喻斌等[40]研究表明,合成冰片與川芎配伍對血腦屏障通透性的降低作用及對腦缺血大鼠的保護(hù)作用均優(yōu)于單用川芎,并且中劑量冰片配伍組(160 mg/kg) 療效優(yōu)于低劑量(80 mg/kg)、高劑量(320 mg/kg),表明兩者配伍對腦缺血的保護(hù)作用并非隨冰片劑量增加而增強(qiáng),可能與血腦屏障狀態(tài)、冰片的臨床用法密切相關(guān)。

2.2 機(jī)制研究

2.2.1 下調(diào)NO 水平 NO 作用具有雙重性[41],前者來源于誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS) 的NO 具有神經(jīng)毒性作用,在病理性因素的刺激下其大量表達(dá),生成的NO 因自身毒性或與超氧化自由基結(jié)合得到毒性更大的O2-和OHOO-,使血腦屏障通透性病理性增加,導(dǎo)致神經(jīng)損傷。由此可知,iNOS 參與了血腦屏障的病理性損傷過程。

田徽[35]報道,艾片、合成冰片均可有效降低大鼠腦缺血再灌注損傷后iNOS 表達(dá),從而抑制iNOS 催化合成NO,降低大量NO 所致的神經(jīng)毒性,減輕腦損傷,使血腦屏障通透性降低,發(fā)揮腦保護(hù)作用。王瑋[42]也發(fā)現(xiàn),合成冰片可減少腦損傷大鼠腦微血管中iNOS 表達(dá),減輕過量NO 所致的病理性損傷,進(jìn)而起到保護(hù)腦組織的作用。

2.2.2 抗炎 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP) 幾乎能降解血腦屏障基底膜胞外基質(zhì)的各種蛋白成分,使血腦屏障受損,其中與血腦屏障破壞最為密切的是MMP-9,其表達(dá)僅與炎癥細(xì)胞有關(guān)。例如,TNF-α 可上調(diào)MMPs 表達(dá),從而加重血腦屏障損傷。

王建等[43]研究表明,MCAO 大鼠與假手術(shù)組比較,腦組織MMP-9 表達(dá)顯著,給予天然冰片可下調(diào)其表達(dá),從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。徐攀[44]發(fā)現(xiàn),給予艾片后抗炎活性藥效指數(shù)ETNF-α不斷升高。倪彩霞等[45]研究四味芳香開竅藥對腦缺血再灌注損傷模型大鼠血清TNF-α 水平的影響,發(fā)現(xiàn)合成冰片組與5%吐溫對照組比較,TNF-α 水平顯著降低,提示冰片可抑制其水平、生成、釋放,從而發(fā)揮一定的抗腦缺血作用。

2.2.3 抗自由基損傷 腦組織中各種氧自由基能通過攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸來引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用,形成脂質(zhì)過氧化物[如丙二醛(MDA) ],同時降低超氧化物歧化酶(SOD) 活性及其清除氧自由基的功能。因此,組織內(nèi)MDA 水平和SOD 活性可反映細(xì)胞受自由基損傷的程度。

邵新然[46]發(fā)現(xiàn),天然冰片可使腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織中SOD 活性上調(diào),增強(qiáng)其清除氧自由基的功能。田徽[35]報道,MCAO 大鼠缺血側(cè)腦組織中MDA 水平顯著上升,SOD 活性顯著下降,表明大鼠術(shù)后腦組織受損嚴(yán)重,而艾片、合成冰片可增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力,有效改善自由基損傷程度,從而起到腦保護(hù)作用。

2.2.4 影響相關(guān)基因表達(dá) 細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因Bax、細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl-2 屬于Bcl-2 基因家族,兩者均與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),其中前者過度表達(dá)產(chǎn)物可拮抗Bcl-2 抑制細(xì)胞凋亡的作用,使細(xì)胞趨于死亡。研究表明[47],Bax、Bcl-2與腦缺血時發(fā)生的細(xì)胞凋亡存在因果關(guān)系,由于后者表達(dá)量低于前者,導(dǎo)致兩者比值升高,最終造成細(xì)胞凋亡,血腦屏障破壞,從而誘發(fā)腦缺血。 Claudins 基因的表達(dá)產(chǎn)物是構(gòu)成緊密連接復(fù)合體的主要成分,其表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致血腦屏障緊密連接疏松,故它具有重要的調(diào)節(jié)血腦屏障通透性的作用[31,48]。

Dong 等[49]發(fā)現(xiàn),與腦缺血模型組比較,天然冰片、艾片、合成冰片均可顯著促進(jìn)Bcl-2 基因表達(dá),其中合成冰片還可顯著降低Bax 表達(dá),天然冰片、合成冰片均可顯著降低Bax/Bcl-2 比值,減輕血腦屏障受損程度?，F(xiàn)代藥理研究表明,Bcl-2 表達(dá)產(chǎn)物可通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來抑制細(xì)胞凋亡,降低血腦屏障通透性[50]；Dong 等[49]也發(fā)現(xiàn)與腦缺血模型組比較,天然冰片、艾片、合成冰片均可上調(diào)Claudin-5 表達(dá),腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、毛細(xì)血管基底膜、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞間的連接更緊密,從而降低血腦屏障通透性,發(fā)揮腦保護(hù)作用。王建[43]等報道,天然冰片配伍紅花可通過促進(jìn)Claudin-5 表達(dá)來發(fā)揮對腦缺血損傷的保護(hù)作用。

3 討論

冰片可雙向調(diào)節(jié)血腦屏障通透性,不僅增加生理性血腦屏障通透性,引藥上行,還降低腦組織受損時血腦屏障通透性,發(fā)揮腦保護(hù)作用,并且促進(jìn)、抑制血腦屏障開放的機(jī)制完全不同。其中,冰片增加血腦屏障通透性的機(jī)制主要涉及NO、組胺、P-糖蛋白、5-羥色胺水平及超微結(jié)構(gòu),各機(jī)制之間相互影響,如NO 是介導(dǎo)組胺增加血管通透性的重要物質(zhì),冰片與P-糖蛋白結(jié)合促使5-羥色胺在細(xì)胞內(nèi)含量增加。冰片降低血腦屏障通透性的作用主要與NO水平、炎癥因子、自由基及基因表達(dá)有關(guān),而且不同基因的表達(dá)可對血腦屏障超微結(jié)構(gòu)、抗自由基損傷能力產(chǎn)生影響,可見腦組織處于不同生理病理狀態(tài)時,NO 水平是影響冰片對血腦屏障作用方向的重要因素,而冰片可通過控制其水平來雙向調(diào)節(jié)血腦屏障通透性,具體見圖3。

圖3 冰片雙向調(diào)節(jié)血腦屏障通透性機(jī)制

課題組前期對艾片、合成冰片影響血腦屏障的機(jī)制和腦保護(hù)作用進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)給予兩者后MCAO 大鼠血腦屏障的破壞減輕,緊密連接完整,腦水腫改善,水腫率下降,而且艾片高、低劑量組及合成冰片高劑量組可顯著增加斷頭小鼠張口次數(shù)、延長存活時間,艾片、合成冰片高劑量組均能顯著延長腹腔注射亞硝酸鈉、尾靜脈注射氯化鎂、雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎所致腦缺血小鼠的存活時間,從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。由此推測,其作用機(jī)制可能主要與調(diào)節(jié)NO 通路、P-糖蛋白通路、抗自由基損傷有關(guān)。

雖然3 種冰片對血腦屏障通透性的作用強(qiáng)度無顯著性差異,但艾片在調(diào)節(jié)血腦屏障通透性的作用機(jī)制、腦保護(hù)等方面有優(yōu)于天然冰片、合成冰片的趨勢[25,35],但目前對天然冰片、艾片的研究相對不足,有待進(jìn)一步考察。不同劑量冰片對血腦屏障通透性的作用也有所差異,綜合俞浩[13]、陳群[16]、喻斌[40]實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測它可能與冰片劑量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān),并存在最佳劑量 (可能為200 mg/kg),此時冰片增加或降低血腦屏障通透性的作用最強(qiáng),但超過最佳劑量后反而呈負(fù)相關(guān),具體還應(yīng)結(jié)合其配伍狀況及腦組織生理病理狀態(tài)進(jìn)行深入研究。

隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的進(jìn)一步推進(jìn),有別于傳統(tǒng)給藥形式的冰片現(xiàn)代應(yīng)用研究已取得豐碩成果。冰片配伍電針的針?biāo)幗Y(jié)合療法[51]、載藥透過血腦屏障的冰片-聚乙二醇共修飾固體脂質(zhì)納米粒[52]、具有潛在腦靶向作用的丹參素冰片酯[53]等均不同程度地擴(kuò)大了該藥材的應(yīng)用范圍,尤其是經(jīng)過表面修飾的功能化納米粒,在腦靶向遞藥及診斷、腦部疾病治療方面的應(yīng)用愈加廣泛。

綜上所述,今后對冰片的研究應(yīng)在選擇適宜品種和劑量的基礎(chǔ)上,結(jié)合該藥材影響血腦屏障通透性的相應(yīng)機(jī)制,圍繞它治療現(xiàn)代腦病的作用靶點(diǎn)進(jìn)行,以期實(shí)現(xiàn)其傳統(tǒng)功效與現(xiàn)代制劑(尤其是靶向制劑) 的有機(jī)結(jié)合。