3種杉木種子活力測定方法比較

徐振飛，過晟鵬，錢 旺，包苗清，林二培，黃華宏，童再康

（浙江農(nóng)林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

種子活力是指種子具有的發(fā)芽潛力、生長潛力和生產(chǎn)潛力，是檢驗種子質(zhì)量優(yōu)劣的最可靠指標[1?2]。高活力的種子抗逆性強，具有實現(xiàn)高產(chǎn)量和優(yōu)品質(zhì)的潛在能力[3]。測定種子活力是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的步驟。目前，種子活力的測定方法主要有直接法和間接法2類。直接法指在實驗室模擬一定條件直接測定萌發(fā)率，如低溫發(fā)芽測定[4]和冷凍測定[5]；間接法通過測定某些與種子活力相關(guān)的生理生化指標間接評價種子活力的方法，比較常用的方法如四氮唑法(TTC)測定、電導率測定[6]、加速老化測定[7]等。不同物種的最適種子活力測定方法也不相同。POONGUZHALI等[8]發(fā)現(xiàn)最能正確反映黑吉豆Vignamungo種子活力的方法是加速老化法；電導率法評價紫花苜蓿Medicagosativa種子活力最為敏感[9]；而通過記錄平均胚根突出時間是測定燕麥Avenasativa種子活力高低的重要指標[10]。一般來講，直接法測定種子活力最準確，但較為耗費時間，難以大規(guī)模進行。因此多采用電導率法和TTC法等間接法測定種子活力。TTC法測定種子活力具有方便快速、結(jié)果重復性好等優(yōu)點，主要用于農(nóng)作物種子活力的測定[11]。電導率法根據(jù)細胞膜的完整性來評價種子活力大小，但精度受到標準參考物、溫度、水質(zhì)等因素的影響較大[12]。紫外分光光度計法(UVS)由電導率法改進而來，通過測定種子浸出液的紫外吸光值，來判定浸出液中氨基酸等有機物的相對含量間接推斷種子活力。魯黎明等[13]利用UVS法測定煙草Nicotianatabacum種子活力時發(fā)現(xiàn)：UVS法測定種子活力簡便快捷，準確度較高。杉木Cunninghamia lanceolata是中國南方地區(qū)的優(yōu)良速生用材樹種，生長快、材質(zhì)較好，在中國商品材生產(chǎn)中占有重要地位。杉木種子活力的測定與評價是杉木良種培育、種苗生產(chǎn)和人工林營建的重要環(huán)節(jié)，但由于杉木種子細小、種皮堅硬，胚小易碎等，一般的種子測量方法并不能快速有效檢測。本研究以標準發(fā)芽試驗為參照，比較了TTC法和UVS法測定杉木種子活力的準確性和便捷性，旨在建立一種快速方便且較為準確的種子活力檢測方法。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2017年10月底至11月初，分別收集普通杉木(普杉)ZLP-1、速生型杉木(速杉)ZLS-9、龍15×閩33雙系雜交(雜杉)種子，其中普杉種子和速杉種子采自浙江農(nóng)林大學林木種質(zhì)資源圃，雜杉種子由浙江省開化縣林場提供。另于2018年11月初在浙江農(nóng)林大學林木種質(zhì)資源圃中采集優(yōu)良無性系速1、新6和紅47的半同胞種子用于測定方法驗證。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 采集健康成熟球果，于陰涼通風處晾干；將種子從球果抖出，挑選健康飽滿種子裝入玻璃廣口瓶，密封后置于4 ℃冰箱保存，約6個月后用于種子活力測定。

1.2.2 標準發(fā)芽法 取3個品種杉木種子各150粒，體積分數(shù)為10%的安替福明滅菌15 min，無菌水清洗3次，無菌水中25 ℃浸泡24 h。取無菌培養(yǎng)皿，鋪上無菌濾紙，并用無菌水濕潤；將浸泡后的種子鋪于濾紙上，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)。各樣品重復3次，每5 d 觀察統(tǒng)計發(fā)芽情況，15 d后統(tǒng)計萌發(fā)種子數(shù)，計算平均萌發(fā)率(%)。

1.2.3 TTC法 取3個品種杉木種子各150粒，按1.2.2滅菌浸泡后剝?nèi)シN皮，切下種胚，加質(zhì)量分數(shù)為0.1%的TTC溶液10 mL，置于35 ℃恒溫箱中染色120 min。吸去多余TTC液，清水沖洗1～2次，觀察并記錄被染色的種胚數(shù)。胚染成紅色的為具有活力的種子，計算染色百分率(%)。重復3次。

1.2.4 UVS 取3個品種杉木種子各150粒，蒸餾水清洗2次，超純水清洗1次，濾紙吸干后放入50 mL離心管中，用20 mL超純水在25 ℃下浸泡，于4、8、12、24 h后測定種子浸出液吸光度D(260)。重復3次。以D(260)為x，種子真實萌發(fā)率為y，利用Excel軟件進行線性回歸分析，建立不同時間浸出液與萌發(fā)率間的回歸方程，通過擬合系數(shù)(R2)選定用于種子活力預(yù)測的回歸方程。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Excel及SPSS進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 真實萌發(fā)率

由表1發(fā)現(xiàn)：相同萌發(fā)環(huán)境下，3個品種杉木種子萌發(fā)率差異顯著(P＜0.05)。雜杉種子萌發(fā)初期萌發(fā)率較小，普杉和速杉種子在萌發(fā)初期(5 d)就表現(xiàn)出很高的發(fā)芽勢，均在萌發(fā)15 d時趨于穩(wěn)定。統(tǒng)計萌發(fā)15 d 時的萌發(fā)率發(fā)現(xiàn)：速杉種子萌發(fā)率最高(44.88%)，普杉較低(41.11%)，雜杉最低，僅為37.33%；總體上萌發(fā)率變異系數(shù)較小，均略大于5%。

2.2 TTC 染色法

如表2可知：不同杉木種子的胚染色率存在差異，其中速杉最高(49.78%)，雜杉略低(42.22%)，普杉最低(38.89%)；變異系數(shù)波動較大。

表 1 不同杉木種子真實萌發(fā)率Table 1 Real germination rate of different C.lanceolata seeds

表 2 不同杉木種子胚 TTC 染色率Table 2 TTC staining rate of different C.lanceolata seed embryos

2.3 UVS 法

由圖1可知：隨著浸泡時間延長，同一種子浸出液吸光度[D(260)]呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢；相同浸泡時長下，不同種子浸出液吸光度[D(260)]不同，3種種子間存在顯著差異。速杉種子浸出液紫外吸光值最小，說明萌發(fā)率最高，雜杉紫外吸光值最大，說明種子萌發(fā)率最低，與實際萌發(fā)率一致。對不同浸泡時間下吸光度[D(260)]與真實萌發(fā)率做線性回歸分析，得到回歸方程如下：① 4 h浸泡，y=?0.566 6x+0.449 3(R2=0.953)；② 8 h浸 泡，y=?0.309 7x+0.440 2(R2=0.899)；③ 12 h浸泡，y=?0.506 7x+0.458 8(R2=0.902)；④ 24 h浸泡，y=?0.145 7x+0.444 6(R2=0.689)。由回歸方程可看出4 h種子浸出液的紫外吸光度與萌發(fā)率之間擬合系數(shù)最高(0.953)，說明在本研究條件下，杉木種子浸泡4 h后的浸出液紫外吸光值能夠較好地反映杉木種子的活力。利用該回歸方程計算3個品種種子的萌發(fā)率(表3)，發(fā)現(xiàn)速杉種子萌發(fā)率為44.94%，普杉為41.00%，雜杉為37.39%；且其變異系數(shù)均約為5%。

圖 1 不同浸泡時間下杉木種子浸出液吸光度Figure 1 Absorbance of leaching solution of different C.lanceolata seeds at different soaking times

表 3 浸泡 4 h 后杉木種子吸光度 [D(260)]所對應(yīng)的萌發(fā)率波動Table 3 Fluctuation range of germination rate corresponding to obsorbance[D(260)] of different C.lanceolata seeds soaked for 4 h

2.4 標準發(fā)芽法、TTC 法和 UVS 法的比較

由表4可知：標準發(fā)芽法步驟簡單，但耗時最長；TTC染色法需將種胚剝出染色，操作最為繁瑣，且較為耗時；UVS法操作簡單，耗時也最短。比較3種方法測定的萌發(fā)率(圖2)，TTC法測得的種子萌發(fā)率與實際萌發(fā)率間存在顯著差異(P＜0.05)，UVS法測定的種子活力與實際萌發(fā)率沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.5 UVS 法驗證

為了進一步驗證UVS法的穩(wěn)定性，隨機選取速1、新6和紅47共3個杉木無性系，于2018年11月采集其半同胞種子進行UVS法種子活力測定，同時也采用標準發(fā)芽法和TTC法測定進行比較?；盍y定方法按方法1.2.2，1.2.3和1.2.4進行。結(jié)果如表5所示：UVS法測定的結(jié)果與標準發(fā)芽法較為一致，沒有顯著差異，而TTC法測得的萌發(fā)率與其他2種方法差異顯著，說明UVS法所測得的萌發(fā)率可靠程度較高，也比較穩(wěn)定，是杉木種子活力測定的較好方法。

表 4 3 種方法測定種子活力步驟與耗時比較Table 4 Comparison of three methods for determining seed vigor and time-consuming

3 討論

種子活力可以通過標準發(fā)芽法、加速老化法、TTC染色法和電導率法等多種方法進行評價，但由于受到物種、基因型和環(huán)境等因素的影響，目前并沒有通用的種子活力測定方法[14?15]。因此，針對特定植物進行種子活力測定方法的比較，對于建立適用于特定植物種子活力測定具有重要意義。

作為一種公認的種子活力測定標準方法[16]，TTC法可以根據(jù)種子的種屬、狀態(tài)等調(diào)整染色時間以達到最佳活力檢測效果[17?19]。本研究發(fā)現(xiàn)：由于杉木種子種皮較厚，用TTC法測定活力時需從種子中將胚剝離后再進行染色；此過程不僅費時費力，剝胚時還會造成損傷。同時由于不同種子胚的染色效果存在差異，易造成假陽性，導致活力測定結(jié)果與實際萌發(fā)率偏差較大。UVS法測定時間短、通量高、所需樣本量少，可以有效提高檢測效率，是近年來使用較多的測定種子活力的方法。邊子星等[20]在利用該方法測定瀕危華石斛Dendrobiumsinense種子活力時發(fā)現(xiàn)：浸泡4 h的種子浸出液吸光值與發(fā)芽率相關(guān)性較高，通過擬合回歸方程可快速預(yù)測華石斛的種子活力。岳媛[21]比較了5種杜鵑Rhododendron種子活力測定方法發(fā)現(xiàn)，UVS法(種子浸泡8 h)能較準確地反映出田間出苗的情況，變異系數(shù)相對較小，試驗結(jié)果較穩(wěn)定，可以作為杜鵑花屬植物種子活力測定的方法。本研究首次采用UVS法對杉木種子活力進行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種子浸泡4 h后，種子浸出液吸光度[D(260)]與種子活力間有較高相關(guān)性(R2=0.953)，通過預(yù)測回歸方程可以較好地擬合杉木種子活力。在實際操作中，受試種子往往不同批次、不同年份，因而萌發(fā)率會有較大波動，因此應(yīng)分別計算不同批次種子浸出液吸光值與真實萌發(fā)率的相關(guān)性，從而避免較大的誤差?？傮w上來講，這種方法簡便快速，準確性高，有利于提高測定效率。

綜合上述實驗結(jié)果，本研究認為TTC法在測定杉木種子活力時，檢測準確率與速度上均較差；UVS法可快速檢測杉木種子活力，且操作簡便，尤其對于檢測大量不同杉木種子的活力具有更高效率。

圖 2 3種方法測得萌發(fā)率比較Figure 2 Comparison of germination rates measured by three methods

表 5 3 種測定方法的穩(wěn)定性比較Table 5 Comparison of the stability of the three methods