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    改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌的抗菌活性研究

    2021-01-08 21:25:22楊貴軍劉鼎闊劉芳李源胡鵬程林霖雨管振國(guó)天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室300383
    獸醫(yī)導(dǎo)刊 2021年13期
    關(guān)鍵詞:葡菌鏈球菌試管

    楊貴軍 劉鼎闊 劉芳 李源 胡鵬程 林霖雨 管振國(guó)/天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 300383

    針對(duì)奶牛乳房炎這一疾病,國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了深入研究,但目前這一疾病仍舊是導(dǎo)致奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的疾病之一。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等病原微生物是造成奶牛乳房炎最為主要的病原體。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),乳酸鏈球菌素對(duì)奶牛乳房炎具有顯著的治療效果。同時(shí),有研究表明,乳酸鏈球菌素在一定條件下對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用。

    1 試驗(yàn)?zāi)康?/h2>

    本試驗(yàn)旨在檢測(cè)改構(gòu)乳酸鏈球菌素在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌是否具有抗菌活性。

    2 試驗(yàn)材料

    2.1 菌株鏈球菌(Streptococcus)臨床菌株L 1473、L 4732、L 2348、L 2853、L 1463 和L 5321 與大腸桿菌分離株來(lái)自同樣的兩個(gè)奶牛場(chǎng)的乳房炎患牛;金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 1717 和ATCC 29213:購(gòu) 自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection,ATCC);臨床菌株S 1963、S3210、S1689 和S2425 與鏈球菌、大腸桿菌分離株來(lái)自同樣的兩個(gè)奶牛場(chǎng)的乳房炎患牛。大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 43895 和ATCC 43890:購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection,ATCC);臨 床菌株EC3521、EC5632、EC3478 及EC2569大腸桿菌分離株:取自兩個(gè)奶牛場(chǎng)的乳房炎患牛。

    2.2 儀器UV~2600 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海尤尼柯);電子天平(深圳市恒志??萍加邢薰荆?;8037~SVD 壓力蒸汽滅菌鍋(山東博科消毒設(shè)備有限公司);THZ~82 恒溫?fù)u床(上海躍進(jìn));微量移液器(德國(guó)艾本德);超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián));其它玻璃儀器(北京鼎國(guó))。

    2.3 藥品和試劑供試品:改構(gòu)乳酸鏈球菌素,由天津市生物飼料添加劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。效價(jià):2000IU,經(jīng)檢驗(yàn)合格。

    MH 肉湯培養(yǎng)基(MHB)(BD Biosciences);二甲基亞砜(DMSO)(sigma)。

    2.4 試驗(yàn)所需試劑的配制

    (1)藥物配制:精確稱取改構(gòu)乳酸鏈球菌素,溶解于DMSO 中,配制成濃度為51200 μg/mL 的母液,備用。

    (2)MHB 培養(yǎng)基:稱取MHB 粉末21.0 g,加熱溶解于1000mL 蒸餾水中,121℃高壓滅菌15min,備用。

    3 試驗(yàn)方法

    3.1 細(xì)菌培養(yǎng)取各受試菌的甘油保存液,以1∶100 接種到3~5mL 各自適宜的培養(yǎng)基中,置于37℃搖床中震蕩培養(yǎng)18~24 h,再劃線接種于瓊脂平板上,置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。挑取各平板上的單菌落,接種于液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,再次劃線接種于瓊脂平板上。生化培養(yǎng)箱中靜置過(guò)夜后,用封口膜密封,置于4℃環(huán)境保存。再次挑取各平板上的單菌落,接種于MHB 培養(yǎng)基中,置于37℃搖床中振蕩培養(yǎng)10~12 h 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600,用MHB 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)菌濃度至5×108CFUs/mL,待用。

    3.2 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定取高壓滅菌后的試管置于超凈工作臺(tái)中,12 支試管為一行。每行第一支試管中加入1975 μL MHB 培養(yǎng)基,其余試管均加入1mL 培養(yǎng)基。然后于第1 個(gè)試管中加入改構(gòu)乳酸鏈球菌素儲(chǔ)備液25 μL,混勻后依次進(jìn)行倍比稀釋(藥物經(jīng)稀釋后DMSO 含量不超過(guò)1%),使得改構(gòu)乳酸鏈球菌素的濃度依次為512、256、128……1 μg/mL 共10 個(gè)濃度梯度。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。而最后一支為不加待測(cè)藥物的陰性對(duì)照。每支試管中加入5 μL 稀釋后的菌液,使得每支試管的菌液濃度為 5×105CFUs/ml。每組重復(fù)三次。將試管架置于生化培養(yǎng)箱中 37℃靜置培養(yǎng)12~24 h 后觀察,記錄結(jié)果。以沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

    3.3 最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定取高壓滅菌后的試管置于超凈工作臺(tái)中,7 支試管為一行。每行第一支試管中加入濃度為16 MIC 改構(gòu)乳酸鏈球菌素,充分混勻后,依次2 倍稀釋至第五支試管。余下的試管一支為只加菌液的陰性對(duì)照,另一支為只有培養(yǎng)基的空白對(duì)照。加入5 μL 稀釋后的菌液,使得每支試管的菌液濃度為 5×105CFUs/ml。每組重復(fù)三次。將試管架置于生化培養(yǎng)箱中 37℃靜置培養(yǎng)12~24 h 后,分別用直徑4 mm 的接種環(huán)取一環(huán)樣液劃線接種于各自適宜的固體培養(yǎng)基上,于37℃孵育48 小時(shí)。觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng),以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度作為最小殺菌濃度。。

    4 試驗(yàn)結(jié)果

    4.1 改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌的最小抑菌濃度(MIC)本實(shí)驗(yàn)采用試管二倍稀釋法考察了改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)引起奶牛乳房炎的三大主要病原菌的抗菌活性。結(jié)果,改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)所測(cè)的6 株金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng),其MIC 值在0.02~0.06 μg/mL 范圍之內(nèi)。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,即使金葡菌對(duì)其他抗生素具有不同的敏感性,但是對(duì)耐藥金葡菌(ATCC 1717)及不耐藥金葡菌(ATCC 29213)對(duì)改構(gòu)乳酸鏈球菌素的敏感性并未受此影響。并且,改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)臨床分離金葡菌的抑菌作用,與其對(duì)標(biāo)準(zhǔn)(耐藥和不耐藥)菌株的抑菌作用基本上在同一水平,均具有較強(qiáng)的抑菌性。本研究中改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)6 株鏈球菌的抑菌作用與其對(duì)金葡菌的抑菌作用水平相似,MIC 值范圍為0.04~0.06 μg/mL;改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)本研究所測(cè)的6 株大腸桿菌的MIC 值范圍為0.062~0.115 μg/mL。

    4.2 改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌最小殺菌濃度(MBC)根據(jù)最小抑菌濃度,調(diào)整改構(gòu)乳酸鏈球菌素受試濃度。結(jié)果表明,改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌所試菌株的MBC 基本在MIC~4MIC之間。三種菌株的MBC 依次分別為0.04~0.16 μg/mL、0.09~0.15 μg/mL 及0.15~0.32 μg/mL。若依據(jù)細(xì)菌對(duì)所試藥物產(chǎn)生了耐藥性的MBC 標(biāo)準(zhǔn)為MBC≥32 MIC,則本試驗(yàn)中18 株試驗(yàn)菌株對(duì)改構(gòu)乳酸鏈球菌素均未產(chǎn)生耐藥性。

    5 結(jié)論

    分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),改構(gòu)乳酸鏈球菌素對(duì)于金葡菌、鏈球菌和大腸桿菌的抑菌及殺菌作用較強(qiáng)。這一結(jié)果提示改構(gòu)乳酸鏈球菌素是一種潛在的可開(kāi)發(fā)為抗奶牛乳房炎感染的新藥物。

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