MicroRNAs 與中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病相關的研究進展

江張勝，田麗偉，趙晨玲，董 婷

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s Disease，AD）、帕金森?。≒arkinson’s Disease，PD）、亨廷頓舞蹈?。℉untington’s Disease，HD）和肌萎縮性脊髓側索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，被認為是危害較大的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，已成為世界性衛(wèi)生保健難題［1-2］.上述中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病目前尚不能完全治愈，僅可通過藥物改善其癥狀.因此，需要深入研究AD、PD、HD、ALS 4 種疾病的發(fā)病機制，以提高其臨床診治效果.miRNAs 參與神經(jīng)元的早期分化和發(fā)育且影響神經(jīng)元的功能，miRNAs 的失調在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］的發(fā)病機制中至關重要.為了更好地理解miRNAs 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性中作用的分子機制，本文從miRNAs、miRNAs 與中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的關系進行論述，力求為臨床防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病奠定理論基礎.

1 miRNAs 概述

1.1 miRNAs 的生物合成特點

miRNA 是長度為20～24 個核糖核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA 分子，是重要生物過程中已知調控因子，在介導RNA 的剪切或翻譯抑制中發(fā)揮著重要的調控作用.miRNA 基因通常被RNA 聚合酶II 轉錄為原始RNA，通過核糖核酸外切酶III 剪切成發(fā)簪狀的前體miRNA（pre-miRNA），然后通過輸出蛋白Ⅴ［4］輸出到細胞質中.在細胞質中，pre-miRNA 被核糖核酸內切酶切割成miRNA 雙鏈，其中一條鏈被載入RNA 誘導沉默復合體（RISC）中的Argonaute（AGO）蛋白中，并作為與蛋白編碼RNA（mRNA）結合的引導序列與靶基因mRNA 的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）堿基的互補配對發(fā)揮其沉默靶基因的表達作用［5］.

研究表明，超過60%的人類基因是由miRNAs調控的，miRNAs 被證明大多數(shù)存在于腦組織、腦脊液和血清中.從腦組織活檢中收集到miRNAs 的表達可以反映腦細胞外間隙液的組成，并作為疾病的非侵入性生物標記物［6］.

1.2 miRNAs 的作用機制

研究表明，miRNAs 的典型作用機制是基于序列互補性與3’UTR 的相互作用.最近的研究表明，miRNAs 的作用機制多種多樣，包括與5’非編碼區(qū)相結合對功能產生影響［7］.其具體的作用機制是miRNAs 與其靶基因之間的相互作用通過影響mRNAs 的穩(wěn)定性或影響蛋白質翻譯而改變蛋白質輸出.重要的是，miRNAs 與其靶mRNAs 之間的絕對序列互補不是必要的；這種靈活性意味著每個miRNA都可以結合和調控大量的mRNAs.因此，轉錄抑制會對靶基因進行調節(jié)，通常是同一個靶基因會結合多個miRNAs 協(xié)同作用.這些調控主要依賴于miRNAs 的核心機制和信號轉導之間的相互作用，以應對外部或內部刺激，并動態(tài)塑造miRNAs 的產生程度，以維持特定的生理或者病理生理條件下穩(wěn)健的基因表達.

1.3 miRNAs 的特點和檢測

miRNAs 是穩(wěn)定的，能夠抵抗內源性RNAs活性的降解.它們能夠承受惡劣的環(huán)境條件，如極端pH 值水平、長期儲存和多種不同類型體液中的多次凍融循環(huán)［8］.此外，可以使用不同的生物學技術，如二代測序（NGS）、定量實時聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和微陣列分析等，對miRNAs 進行定量檢測.目前應用最廣泛的方法是qRT-PCR，因為它操作簡單、靈敏度高，能夠檢測較低水平的miRNAs，但只能應用于有限數(shù)量的miRNAs.NGS 允許對整體miRNAs 的表達水平進行定量分析，包括低豐度的miRNAs.此外，它還可以用來檢測新的miRNAs，但NGS 明顯比其他方法昂貴許多.因此，它可能被用來探索疾病特異性miRNAs 指紋圖譜，但目前還不適合用于臨床診斷［9］.微陣列分析能夠檢測約2 000 種選定的miRNAs，分析需要更大數(shù)量的RNA，且重現(xiàn)性較低，存在交叉雜交的問題［10］.對于所有的方法，人們希望從樣本中提取出所有miRNAs，是具有挑戰(zhàn)性的.因為與蛋白質等相比，體液中的miRNAs 濃度相對較低，再加上目前缺乏常規(guī)化、標準化的方法，導致miRNAs 仍處于初期階段，無法成為廣泛使用的生物標志物.

2 miRNAs 作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在生物標志物

miRNAs 有可能被用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的早期準確診斷，這有利于患者獲得更早和更個性化的靶向治療.盡管miRNAs 作為疾病新的生物標志物潛在價值的研究數(shù)量顯著上升，但是關于miRNAs 與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間關系的認識仍然存在著很大的差距.中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生物標志物的發(fā)現(xiàn)由于涉及腦的作用機制、腦組織的難以獲取、復雜的神經(jīng)解剖和大腦的功能而滯后.此外，還跟環(huán)境與基因的相互作用、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特異性、人群樣本分層等不同的作用因素有關.本文主要綜述4 種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，即AD、PD、HD、ALS，這些疾病均與認知障礙有關.研究了不同疾病內部和不同疾病之間miRNAs 失調的異同，對miRNAs 作為腦病理中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病生物標志物的潛在價值進行綜合評估.

3 中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病特異性生物標志物

3.1 miRNAs 與AD

AD 是一種不可逆的、進行性的大腦紊亂、伴隨記憶和思維能力減退的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病.AD 早期的主要病理特征是患者腦脊液中β 淀粉樣蛋白水平的下降、磷酸化tau 蛋白以及總tau 蛋白水平升高［11］，AD 的發(fā)病還與凋亡、炎癥、細胞周期異常等多種因素 密 切 相 關［12］.miRNAs 參 與 并 調 控AD 的 病理過程，如對CREB/LAK2/STAT3 信號通路的調控作用，參與tau 蛋白磷酸化和神經(jīng)細胞凋亡等過程，β 淀粉樣蛋白代謝和炎癥、凋亡等基因都很有可能作為miRNAs 作用的靶點.

大量的人和動物實驗研究表明，異常的大腦miRNAs 靶向mRNAs 表達可能參與了AD的發(fā) 生［13-14］.在海 馬體 中，KOCERHA［15］等發(fā)現(xiàn)miR-9、miR-125 和miR-128 被持續(xù)地改變.在AD 的早期階段，miR-9 的變化在大腦皮層和海馬區(qū)明顯，這與β 淀粉樣斑塊形成和神經(jīng)退行性變相對應.然而，小腦在疾病的后期會表現(xiàn)出淀粉樣蛋白積累和神經(jīng)元萎縮的現(xiàn)象.miR-29 家族的缺失可能會導致淀粉樣蛋白裂解酶1 蛋白（BACE1）/β 淀粉樣蛋白酶水平的增加，導致散發(fā)性AD 的發(fā)生.同樣，大腦中miR-107 的下調，上調BACE1 mRNAs 水平與AD 的發(fā)生有關［16］.

KEMPF 等［17］報 道，miR-132 的 變 化 主 要發(fā)生在顯示tau 過磷酸化的神經(jīng)元中，而miR-212 主要在非神經(jīng)元細胞中表達.在大腦的許多區(qū)域，包括海馬體、前額葉和顳葉皮層、顳葉和額葉內側回以及小腦，它們都被下調.胼胝體也是與記憶形成相關的大腦區(qū)域.MARTIN 等［18］強調，胼胝體中miR-146 的增加不僅與AD 有關，還與癲癇和多發(fā)性硬化有關.顳區(qū)miR-501-3p 的上調腦皮質可導致AD［14］患者死后腦血管損傷和血腦屏障破壞.血液miRNA 變化是AD 理想的診斷生物標志物［19-20］.在一項大型研究中，GUO 等［21］報道了血清中的miRNAs（miR-26a-5p、miR-181c-3p、miR-126-5p、miR-22-3p、miR-148b-5p、miR-106b-3p）標志物作為AD 早期診斷的無創(chuàng)生物標志物.MüLLER 等［22］發(fā)現(xiàn)，在腦脊液中，miR-29a 作為生物標志物診斷AD 的敏感性為89%，特異性為70%.miR-139 通過調控大麻素受體2（CB2）介導的神經(jīng)炎性過程參與AD 的發(fā)病，miR-139 通過下調CB2 的表達促進神經(jīng)炎性反應.

綜上所述，深入研究miRNAs 在AD 發(fā)病機制中的作用有利于為AD 的診斷提供新的生物標志物，為臨床靶向治療AD 提供更大的幫助.

3.2 miRNAs 與PD

PD 是老年人最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，涉及大腦多巴胺能神經(jīng)元進行性丟失，表現(xiàn)為運動功能障礙和靜息性震顫、運動遲緩、僵直、姿勢不穩(wěn)、認知障礙等臨床癥狀［23］.目前，PD 的臨床治療主要以癥狀性治療為主，包括兒茶酚-O-甲基轉移酶（COMT）抑制劑、單胺氧化酶B 抑制劑等藥物治療，以及深部腦刺激等非藥物干預［24］.雖然這些治療可以緩解帕金森病的運動癥狀，但它們在本質上并不能起到神經(jīng)保護作用，也不能阻止疾病進展或逆轉神經(jīng)退行性變.因此，許多人致力于了解PD 的發(fā)病機制，以發(fā)展神經(jīng)保護治療.

最近，miRNAs 被發(fā)現(xiàn)受到PD 風險基因的調控，并很有可能通過對線粒體和免疫途徑直接調控PD 的發(fā)生.研究表明，miR-29 可調節(jié)PD 發(fā)展的各種重要過程，如細胞凋亡和神經(jīng)元存活、細胞衰老、運動功能調節(jié)、免疫調節(jié)［25-26］.此外，ROSHAN 等證明，在小鼠大腦中抑制miR-29 會導致大量細胞死亡，尤其是海馬和小腦細胞死亡，這些小鼠還表現(xiàn)出共濟失調的特征，如步長縮短，這表明miR-29 在運動協(xié)調中的作用［27］.miR-29b 通過靶向促凋亡bh3 家族的基因來抑制細胞凋亡，從而促進神經(jīng)元存活.CHOI 等［28］發(fā)現(xiàn)miR-7 在PD 患者中的黑質多巴胺能神經(jīng)元中廣泛表達，并且通過體外實驗發(fā)現(xiàn)miR-7 可以促進SH-SY5Y細胞的糖酵解，使其產生更多的ATP 以滿足神經(jīng)元活動能量的需求，可以有效地減少多巴胺能神經(jīng)元的變性壞死.LI 等［29］發(fā)現(xiàn)miR-221 通過靶向作用PTEN 來調節(jié)PC12 細胞活力和凋亡，從而在PD 中起保護作用.韓凱［30］發(fā)現(xiàn)外周血清miR-103a、miR-30b 和miR-29a相對表達量，可以用于PD 早期診斷的無創(chuàng)新型標志物.ZHANG 等［31］利用逆轉錄定量PCR方法對46 例散發(fā)性帕金森病和49 例正常對照組血漿中miRNAs 的水平進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)PD 患者的循環(huán)miR133b 和miR-433 表達水平較正常對照組明顯降低，miR133b 和miR-433 在對照組和PD 組中均呈現(xiàn)很強的相關性.表明miR133b 和miR-433 可能作為PD 的潛在生物標志物.

綜上所述，深入研究miRNAs 在PD 中的表達異常有利于為PD 的診斷提供新型生物標志物，為臨床進一步對PD 的早期診斷和治療提供新的思路和手段.

3.3 miRNAs 與HD

HD 是一種常染色體顯性遺傳性神經(jīng)退行性疾病，其特征是進行性運動、行為和認知能力下降.HD 患者的病變是由染色體4 號上杭丁頓基因（HTT）的三核苷酸重復擴增，該基因產物HTT 蛋白在人類神經(jīng)元中廣泛表達，具有多種功能.在一般人群中，HTT 基因中 平 均 有17～20 個CAG 重 復.CAG 重 復40 次以上，HD 的外顯率為100%，臨床表現(xiàn)的癥狀越重.miRNAs 是一種功能性小的非編碼RNA，也受到突變HTT 蛋白的影響.

研究發(fā)現(xiàn)，miR-128a、miR-34a 在HD 模型小鼠中表達降低.miR-128a 調控包括HTT 和Huntington 相互作用蛋白Ⅰ在內的HD 典型信號 基 因.KOCERHA 等［15］研究 表明，miR-128a腦中的表達水平在HD 病人的臨床表現(xiàn)出現(xiàn)前后均有下調的趨勢，提示miR-128a 參與HD的 發(fā) 病過程.HOSS 等［32］鑒 定 了HD 患者 的 腦中有75 個miRNAs 差異表達，存在5 個miRNAs（miR-10b-5p、 miR-196a-5p、 miR-196b-5p、miR-10b-3p 和miR-106a-5p）被確認與CAG 長度調整發(fā)病年齡有顯著關系，其中包括HD 病例中最強烈過表達的miR-10b-5p.盡管在這些研究中，前額皮質是組織輪廓的來源，但miR-10b-5p 表達與紋狀體參與疾病的關系獨立于皮質參與.miR-124-3p 主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達，在HD 的動物模型中，過表達可以導致癥狀恢復［33］.功能上，miR-124-3p 參與了凋亡信號、自噬、神經(jīng)發(fā)生、谷氨酸信號和免疫調節(jié).在這些動物模型中過表達miR-124-3p 似乎可以調節(jié)這些功能，從而限制或預防疾病的發(fā)生.

綜上所述，深入研究miRNAs 表達的差異性有利于了解miRNAs 參與HD 相關靶基因的調控，為臨床靶向治療HD 提供了一個新的手段.

3.4 miRNAs 與ALS

ALS 是一種以運動皮層、腦干和脊髓的選擇性運動神經(jīng)元變性為特征導致全身進行性肌無力和肌萎縮，最終會導致呼吸麻痹致死［34］的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病.目前，關于ALS 具體的發(fā)病機制并不是十分明確.可能與Cu/Zn 超氧化物歧化酶（SOD1）基因突變、免疫炎性反應、星形膠質細胞功能異常有一定的相關性.miRNAs 能結合互補的靶序列并調節(jié)基因表達，它們是建立神經(jīng)表型和中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變的關鍵分子.因此，特異性的生物標志物可以幫助疾病早期發(fā)現(xiàn)和診斷，也可以作為疾病進展和治療效果的指標.

MARCUZZO 等［35］研究發(fā)現(xiàn)ALS 轉基因鼠模型在晚期階段全腦中miR-9、miR-124a、miR-19a/19b 的表達較正常同齡對照組明顯升高.這些miRNAs 隨后在18 周的ALS 小鼠與同年齡對照組的人工解剖的腦室下區(qū)、海馬體、初級運動皮層和腦干運動核中進行分析.在腦室下區(qū)和海馬區(qū)，miR-124a 表達上調，miR-219 表達下調，神經(jīng)干細胞和祖細胞數(shù)量也顯著增加.在ALS 轉基因鼠腦干運動核和原代運動皮層中，miR-9 和miR-124a 顯著上調，miR-125b 表達升高.KLATT 等［36］發(fā)現(xiàn)，在ALS小鼠模型中，各組織中凋亡介質的上調/下調與miR-29b-3p 的表達水平有關.在ALS 小鼠模型的小腦中，miR-29b-3p 的表達水平顯著增高，使促凋亡因子BMF、Bcl-2、Bax 和Bak1的表達下調，活化Caspase3 從而保護神經(jīng)功能.miR-29 對正常的運動功能是必要的，miR-29a/b 喪失了會引起嚴重的運動障礙［37］.在脊髓中，miR-29b-3p 的表達量有所下降，對促凋亡因子的抑制作用明顯減弱，導致細胞凋亡，從而引起神經(jīng)變性.因此miR-29b 的異常表達水平在ALS 的病因、發(fā)病機制中可能會起十分重要的作用，同時miR-29b 表達水平的特異性很有可能會成為ALS 早期的檢測標準和治療靶點.

綜上所述，miRNAs 與ALS 的發(fā)病機制密切相關，因此深入研究ALS 的發(fā)病機制對臨床靶向治療ALS 有十分重要的意義.

4 miRNAs 參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病

大量的研究已經(jīng)表明miR-29 家族和miR-132-3p 在2 種或2 種以上中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中存在著異常的調控作用，這些miRNAs 似乎在導致認知缺陷的途徑中發(fā)揮了核心作用.下面對相關miRNAs作一簡要闡述.

4.1 miR-29 家族

miR-29 家族似乎在AD、PD、HD 等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中發(fā)揮著主導的作用，該家族的調控基因包括的miRNAs 分別是miR-29b-1、miR-29b-2 和miR-29c，分別是從人類基因組的1 號染色體和7 號染色體轉錄而來的［38］.miR-29b-1 和miR-29b-2 具 有相 同的 成熟序列，而miR-29a 和miR-29c 只存在一個核苷酸差異.研究表明，miR-29 家族與神經(jīng)元的存活、成熟增殖、可塑性、樹突狀棘和突觸形態(tài)相關［38］.

BAI［38］等 表明，PD 患 者的血 清中miR-29家族均呈現(xiàn)下降的趨勢.但有趣的是，與miR-29b 相 比，PD 患 者 中miR-29a 和miR-29c的下降水平較大.因此有人指出在人類基因組中，miR-29b 的復制可能與其家族的其他miRNAs 相比有不同的方式影響其表達.血清中的miR-29a 和miR-29c 的表達水平與PD 的患病的嚴重程度呈負相關，但與疾病的患病持續(xù)時間無關.同時，女性血清miR-29a 和miR-29c 表達水平程度明顯高于男性對照組和PD 患者.眾所周知，PD 患者的男性患病率明顯高于女性.經(jīng)過性別分層分析后發(fā)現(xiàn)，miR-29 的 差 異 主 要 是 在 男 性PD 患 者 中［39］，共同表明PD 中的miR-29 家族呈現(xiàn)特異性的表達水平.因此，有必要進一步研究miR-29家族在PD 患者的生理病理和發(fā)病中的作用，發(fā)現(xiàn)PD 患者的發(fā)病機制與miR-29 家族特異性調控之間存在的關聯(lián)性.雖然BAI 提出血清中miR-29 家族表達水平的失調是PD 患者的特異性表現(xiàn)形式，但也有許多的研究表明AD 患者中miR-29c 表達水平會出現(xiàn)失調，miR-29a 和miR-29b 與BACE1 有一定的關聯(lián)性，促 進AD 病 理 的 生 成［40］.且miR-29a 和miR-29b 水平的降低與腦的絲氨酸棕櫚酰轉移酶和β 淀粉樣蛋白水平升高相關，這表明絲氨酸棕櫚酰轉移酶和miR-29 調控因子通過神經(jīng)酰胺的產生在AD 患者中發(fā)揮重要的作用［41］.

4.2 miR-132-3p

AD、PD、HD 和ALS 中神經(jīng)元的可塑性及相關 通路被證明調節(jié)異常［42］.miR-132-3p 靶向參與神經(jīng)元可塑性的重要通路，如DNA 甲基化和神經(jīng)元cAMP 反應元件結合蛋白（CREB）、N-甲基-D-天冬氨酸受體和BDNF信號［42］.后者似乎在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的病理生理中起著主要作用，并參與神經(jīng)發(fā)育和突觸的調節(jié).miR-132-3p 通過調控BDNF 信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理中發(fā)揮核心作用，導致常見的通路失調，最終導致認知障礙，這是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之間的共同特征［43］.因此miR-132-3p可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療和預后的潛在指標.

5 結語

近年來，隨著生物學研究方法和技術的不斷更新，miRNAs 的功能也被不斷地揭示出來.大量研究表明，miRNAs 轉錄后調控靶基因蛋白質的表達與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制和病理生理有著密切的相關性.在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中miRNAs 調控著神經(jīng)細胞增殖、分化、凋亡的過程；在病理過程中miRNAs 亦在疾病的發(fā)生發(fā)展、損傷后修復等方面發(fā)揮著重要的調節(jié)作用.進一步闡述miRNAs 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中如何調控靶基因的表達并成為疾病的相關靶點，可以為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病機制提供新的分子基礎.

盡管miRNAs 成為早期臨床診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在生物標志物是十分有前景的，但仍存在挑戰(zhàn)性.如存在種族、年齡、飲食和性別等影響miRNAs 表達的相關因素.因此，我們需要更大的樣本量和專門的研究來驗證miRNAs 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的有效性.此外，一種miRNAs 在大腦的不同部位、不同階段發(fā)揮作用機制也大不相同，如何精準地通過靶向藥物通過血腦屏障將miRNAs 遞送到病變部位仍需解決.因此，在miRNAs 成為臨床診治中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病生物標志物之前，技術和方法的改進是十分必要的.