多重實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)在急性視網(wǎng)膜壞死診療中的應(yīng)用

馬清悅 孟 超 胡 磊

山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)1.研究生部，2.生命科學學院，山東 泰安 271016；3.山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院眼科，山東 泰安 271000

急性視網(wǎng)膜壞死(acute retinal necrosis，ARN)是一種罕見的病毒性葡萄膜炎綜合征，其特征是重度全葡萄膜炎伴視網(wǎng)膜動脈炎、周邊大量滲出、視網(wǎng)膜壞死、玻璃體高度混濁以及后期出現(xiàn)視網(wǎng)膜裂孔及視網(wǎng)膜脫離。本病起病急，進展十分迅速，及時精準的治療對其預(yù)后意義重大。眼內(nèi)疾病中皰疹病毒感染的診斷之前常依賴于傳統(tǒng)方法，例如病毒分離方法，但類似于這種檢測方法，通常由于樣本量小和病毒濃度低而導(dǎo)致得到如假陰性等失敗的實驗結(jié)果，因此延誤了診斷，錯過治療的最佳時機。日本ARN研究組在2015年將病因?qū)W診斷依據(jù)納入ARN診斷標準中。多重實時熒光定量PCR技術(shù)是一種建立在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，針對病因?qū)W的更為敏感和特異的實驗室檢測方法，也有利于協(xié)助開展迅速有效的治療，防止長期眼部損傷和視力喪失。為此，本文針對PCR技術(shù)對急性視網(wǎng)膜壞死快速診療過程中的重要作用進行綜述。

1 PCR技術(shù)概述

自20世紀80年代首次被描述以來，PCR已被用于快速準確地擴增樣品中的靶DNA片段[1]。PCR是體外酶促合成DNA或RNA片段的方法。它包括一個反應(yīng)，該反應(yīng)主要包括在高溫變性、低溫退火及適溫延伸等三步，并且其循環(huán)非常短，從而可以迅速擴增DNA或RNA片段，達到數(shù)小時內(nèi)擴增百萬倍的速度。PCR的問世提供了快速、靈敏、樣品需求少的技術(shù)診斷，徹底變革了病原體的檢測方法[2]，已被多個領(lǐng)域重視并應(yīng)用，如其可以用于遺傳病的檢測、在基因?qū)用嫔蠈Σ《炯毦雀腥具M行病原體診斷、對臨床無癥狀的艾滋病病人進行體內(nèi)免疫缺陷病毒感染的監(jiān)測、對白血病細胞的監(jiān)測來判斷白血病復(fù)發(fā)概率及預(yù)后等。諸如此類，PCR技術(shù)的發(fā)現(xiàn)對臨床診斷帶來革命性的意義。有研究表明，PCR技術(shù)比以前常用的Goldmann-Witmer系數(shù)標準病原體方法更為敏感[3]。

2 ARN主要檢測及診斷方法的變革

ARN是一種嚴重危及視力的病毒性葡萄膜炎，屬于眼科急癥[4]。病因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)ARN主要由皰疹病毒引起，最常見的病原體是水痘帶狀皰疹病毒(VZV)，其次是單純皰疹病毒1和2(HSV1和HSV2)[2]。本病起病急驟，病程進展早期也易與其他疾病相混淆，并且病程進展十分迅速。鑒于病原體復(fù)制的快速性會對診斷和治療方向造成干擾，故及時準確的對ARN作出診斷對治療及預(yù)后意義重大[5]。最早對于病原體的判斷方法，主要依賴于一些傳統(tǒng)的實驗室檢查技術(shù)包括血清抗原抗體檢測、病毒培養(yǎng)檢查等，但由于血眼屏障(包括房水屏障和視網(wǎng)膜血屏障)的存在，血液中病原微生物和免疫指標的檢測難以準確反映出眼局部感染情況，故在臨床應(yīng)用中存在局限性，后來對于眼內(nèi)疾病中皰疹病毒感染的診斷，常依賴于傳統(tǒng)的例如檢眼鏡觀察、病毒分離方法等，但根據(jù)眼部體征及常規(guī)實驗室檢查的方法診斷準確率不高，并且也會由于樣本量小和病毒濃度低而導(dǎo)致得到諸如假陰性等失敗的實驗結(jié)果，因此延誤了診斷，進而耽誤治療的最佳時機[6]。相比1994年美國葡萄膜炎協(xié)會對ARN的診斷主要是根據(jù)眼部表現(xiàn)及病程演變方面，日本ARN研究小組在2015年診斷標準中將眼局部眼內(nèi)液病因?qū)W檢測結(jié)果補充為ARN診斷標準之一[7]。Takase等[1]提出制定該標準的兩點原因，首先，ARN的診斷應(yīng)與眼內(nèi)液的病毒學檢測結(jié)果相結(jié)合，其次，新的診斷標準可以幫助疾病進行早期診斷對應(yīng)的病原體從而獲得更好的視覺預(yù)后。病毒性眼部感染的早期診斷和及時治療可能有助于預(yù)防嚴重的眼部結(jié)構(gòu)損害，并有助于維持良好的視覺功能[8]。

在眼部結(jié)構(gòu)上分析，進行眼內(nèi)液檢測也是很有必要的。眼內(nèi)液是眼球液的總稱，包括房水、玻璃體液、視網(wǎng)膜下液和脈絡(luò)膜上積液。由于眼球是一個封閉的球體，并且有血眼屏障(包括房水屏障和視網(wǎng)膜血屏障)的存在，房水的成分與血漿有很大不同，因此血液中病原微生物和免疫指標的檢測很難準確反映出眼睛的局部狀況。國外已有研究證實，眼內(nèi)液樣品(房水或玻璃體)的PCR分析已被用作診斷感染性葡萄膜炎疾病并被確認是臨床懷疑的有效、高度靈敏和特異的檢測方法[9]。

3 多重實時熒光定量PCR技術(shù)進展與ARN快速診治

傳統(tǒng)的PCR技術(shù)是一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度，如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運行，并且需要相對大量的樣本才能對多種傳染源進行分析。實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction)技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，它的技術(shù)原理是在擴增時加入了用同位素及熒光素等標記的引物，使引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合并擴增，實現(xiàn)了在加熱冷卻循環(huán)中監(jiān)測熒光強度，此熒光強度與靶DNA的初始濃度成正比，這樣就可在計算機上觀察到量化的實時結(jié)果的輸出。它的出現(xiàn)使分子診斷領(lǐng)域發(fā)生了重大變革，使得普通PCR技術(shù)實現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，在接下來的幾年間，在此基礎(chǔ)上又增添了多重性的功能。這種精確、敏感、污染少的核酸定量技術(shù)，對傳染病的快速診斷、病毒分型、耐藥突變體監(jiān)測以及新發(fā)傳染病病原體快速監(jiān)測等方面發(fā)揮重要作用，并已在臨床醫(yī)學及生物醫(yī)學基礎(chǔ)科研中得到廣泛應(yīng)用[10]。

得益于以上技術(shù)路線的進展，與以往應(yīng)用普通PCR技術(shù)相比，多重實時熒光定量PCR技術(shù)在急性視網(wǎng)膜壞死快速診斷應(yīng)用中主要有以下重要意義：

第一，通過一次可靠、靈敏且特異性強的實驗室檢查來明確感染的病因，可將正確的診斷時間和治療開始時間盡量提前，從而盡可能保留視力并預(yù)防后期并發(fā)癥，例如視網(wǎng)膜脫離、眼內(nèi)瘢痕形成和永久性視力喪失[11]。其靈敏性表現(xiàn)在可以在不到0.1 mL眼內(nèi)液的情況下一次準確檢測出最常見的病原體[12]。即使對于很小的眼內(nèi)液樣本，PCR檢測的陰性預(yù)測值的價值也很高[1]。Wendy等人[13]通過對所收集的15年來的數(shù)據(jù)的分析表明，有大約18%的ARN患者也同時伴有皰疹病毒性角膜炎，皰疹病毒性角膜炎可發(fā)生在ARN診斷之前、同時或之后。故當患者患有皰疹病毒性角膜炎等諸如此類的疾病時，對患者進行仔細的眼前段檢查及眼內(nèi)液PCR檢測都是十分有必要的，以查明是否并發(fā)疾病。盡管眼內(nèi)液的PCR檢測是一種侵入性的檢測方法，但它在識別葡萄膜炎疾病的感染病學病因方面起著舉足輕重的作用，因此應(yīng)被視為是任何可疑的感染性葡萄膜炎的輔助檢查[15]。

該技術(shù)對于排除一些鑒別診斷也發(fā)揮重要的作用[15]。例如，最近的一項研究報道了1例根據(jù)臨床表現(xiàn)該患者被認為是由于免疫抑制而繼發(fā)于皰疹感染的進行性外層視網(wǎng)膜壞死，然而，通過進一步對該患者的多重實時定量PCR技術(shù)分析，卻發(fā)現(xiàn)有弓形蟲的存在，這樣在治療上轉(zhuǎn)變針對弓形蟲感染的抗微生物治療會帶來更大的預(yù)后收益[16]。并且，多重實時定量PCR技術(shù)甚至能夠可靠地檢測出樣本存在著的少量的病毒或寄生蟲DNA，從而確定或排除對感染的懷疑，使皮質(zhì)類固醇或其他免疫抑制的療法及時放心的應(yīng)用[17]。通過以上這些例子，也證實了在某些情況下，由于臨床體征可能重疊，多重實時熒光定量PCR技術(shù)是確保準確診斷和隨后有效治療的寶貴工具。文獻報道，很多實驗室都開始使用多重實時熒光定量PCR技術(shù)來準確識別感染性病因，這可能會成為標準的實驗室診斷方法[19]。

多重實時熒光定量PCR技術(shù)使鑒定和定量病毒基因組成為可能，它可以提供每毫升病毒拷貝數(shù)的信息，還可用于監(jiān)測隨著時間的推移病原體對治療的反應(yīng)[16]。其可以定量測定病毒的優(yōu)勢有利于對疾病進展及預(yù)后及時判斷[19]。并且由于該技術(shù)的實時性，檢測人員可以在加熱/冷卻循環(huán)中監(jiān)測熒光強度，該強度是與靶DNA的初始濃度成正比的，因此，可以確定在這些循環(huán)中什么時候可以最早檢測到目標DNA，同時也可以確定樣品中檢測到的靶序列的濃度[20]。檢測過程中可將引起急性視網(wǎng)膜壞死等感染性葡萄膜炎的多種常見病原體組合到一個多重檢測法中，而且所有靶目標的檢測均可在2 h左右完成，由此也具有縮短實驗室報告時間的額外優(yōu)勢[21]。

此外，與玻璃體液相比，抽取前房水是一種更安全、侵入性更小的技術(shù)[22]。但需要注意到的一點是，相同情況下，玻璃體液的病毒檢出陽性率可能高于前房水，并且在未用藥或用藥1周內(nèi)檢測的陽性率較高。在臨床實踐中我們也要考慮到不同樣本的特性。

4 總結(jié)和展望

綜上所述，基于精準醫(yī)學原則的多重實時熒光定量PCR技術(shù)是快速確診或排除如急性視網(wǎng)膜壞死等感染性葡萄膜炎為病因的疾病的重要診斷工具，可以節(jié)省檢測時間，提高檢測的準確率，為病原體的早期檢出提供準確信息。但仍有一些亟待解決的問題，如部分樣本如玻璃體液獲得方式相對不易，并且目前檢驗成本較高，因此作為一種臨床常規(guī)檢查受到一定限制。但不可否認的是，在更多具有挑戰(zhàn)性的感染性葡萄膜炎病例中，該技術(shù)會成為眼科診斷標準的重要組成部分。