Nrf2為靶點(diǎn)治療支氣管肺發(fā)育不良的研究進(jìn)展

張晗碩，梅 花，張亞昱

0 引言

支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)是早產(chǎn)兒呼吸系統(tǒng)的一種常見(jiàn)病，被認(rèn)為是繼發(fā)性的高氧和炎癥造成的氧化損傷，從而導(dǎo)致肺泡形成障礙和慢性肺功能障礙，其危險(xiǎn)因素可分為個(gè)體因素、醫(yī)源性因素和外部因素[1-2]。隨著極低出生體重兒和超低出生體重兒存活率的不斷增加,BPD已經(jīng)成為早產(chǎn)兒呼吸系統(tǒng)最重要的合并癥，嚴(yán)重者可并發(fā)肺動(dòng)脈高壓，影響遠(yuǎn)期呼吸功能、神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后[3]。

Northway等[4]在1967年首次將BPD定義為因機(jī)械通氣而導(dǎo)致的有呼吸窘迫綜合征的早產(chǎn)兒產(chǎn)生的肺病。美國(guó)國(guó)立兒童健康與人類發(fā)育研究所于2001年發(fā)表了BPD的診斷和分度標(biāo)準(zhǔn)，后于2018年修定了更為細(xì)化的BPD定義及分度標(biāo)準(zhǔn)。中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)新生兒學(xué)組聯(lián)合中華兒科雜志編輯委員會(huì)于2020年發(fā)表了更符合我國(guó)國(guó)情的BPD臨床管理專家共識(shí)[5]。雖然新生兒護(hù)理的發(fā)展提高了早產(chǎn)兒的存活率，但在降低BPD發(fā)生率方面取得的進(jìn)展有限[6]。我國(guó)幾項(xiàng)多中心報(bào)道的BPD發(fā)生率差異較大[5]，其發(fā)生率居高不下的部分原因是可用于預(yù)防和治療BPD的選擇有限。所以,BPD仍是早產(chǎn)兒高發(fā)病率和高死亡率的主要原因，BPD的治療也仍然是一個(gè)重要的臨床問(wèn)題。

1 Nrf2概述

核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor E2related factor 2,Nrf2)由605個(gè)氨基酸組成，分為7個(gè)功能域，分別稱為Neh1～Neh7：Neh1結(jié)構(gòu)域含有1個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(CNC-bZIP)，為DNA結(jié)合域；Neh2結(jié)構(gòu)域是1個(gè)N端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，包含7個(gè)影響泛素結(jié)合的賴氨酸殘基和2個(gè)肽結(jié)合基序(ETGE和DLG)，ETGE和DLG基序與Keap1相互作用，它們通過(guò)促進(jìn)Nrf2與不同蛋白質(zhì)的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)Nrf2的穩(wěn)定性；Neh3結(jié)構(gòu)域?yàn)槿旧|(zhì)解螺旋酶DNA結(jié)合蛋白6結(jié)合域；Neh4和Neh5結(jié)構(gòu)域?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子結(jié)合域；Neh6為β- 轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相容蛋白(β-TrCP)結(jié)合域；Neh7結(jié)構(gòu)域?yàn)橐朁S酸Ⅹ受體α(RⅩRα)結(jié)合域[7-10]。

Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)由624個(gè)氨基酸組成，分為5個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中包含的Kelch重復(fù)序列被認(rèn)為介導(dǎo)Keap 1與Nrf2和p62蛋白的結(jié)合[11-12]。平衡條件下，Keap1通過(guò)N-末端BTB結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同二聚化，并與Cull 3 E3連接酶結(jié)合，形成Keap 1-Cull3-RBX1(環(huán)盒蛋白-1) E3連接酶復(fù)合物，導(dǎo)致Nrf2泛素化和降解；在應(yīng)激條件下，Nrf2從Keap1-Cul3-RBX1復(fù)合物中釋放出來(lái)，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與小Maf蛋白(sMaf)異二聚體化，并與抗氧化反應(yīng)元件(AREs)結(jié)合，導(dǎo)致ARE驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄[13]。Nrf2/ARE通路在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[14]，該通路可調(diào)控谷胱甘肽和硫氧還蛋白抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵組分的表達(dá)，參與內(nèi)外源代謝產(chǎn)物的Ⅰ期、Ⅱ期解毒，調(diào)節(jié)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)再生和血紅素代謝，同時(shí)亦與許多腫瘤、炎性疾病、神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，已成為新型治療靶點(diǎn)[15-17]。

2 Nrf2為靶點(diǎn)治療BPD的依據(jù)-Nrf2對(duì)BPD的保護(hù)作用

由于人們經(jīng)常暴露在外部環(huán)境中，接觸各種污染物和其他氧化劑，所以Nrf2維持的氧化還原平衡對(duì)呼吸道相當(dāng)重要。目前研究顯示，Nrf2缺失會(huì)導(dǎo)致各種呼吸系統(tǒng)疾病的高度易感性和嚴(yán)重?fù)p傷，包括BPD、呼吸道感染、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、特發(fā)性肺纖維化和肺癌等，相反，Nrf2的激活對(duì)這些肺部疾病具有保護(hù)作用[15]。

Chu等[18]將早產(chǎn)大鼠暴露在高氧環(huán)境中，結(jié)果早產(chǎn)大鼠肺發(fā)育遲緩，其病理變化與BPD相似，發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)大鼠高氧暴露后，Nrf2和血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達(dá)明顯增加，具有保護(hù)作用。Zhang等[19]檢測(cè)了早產(chǎn)SD大鼠肺組織和高氧暴露的A549細(xì)胞中Nrf2和miR-125b的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)大鼠肺組織中Nrf2和miRNA-125b在高氧暴露后明顯升高，具有保護(hù)作用。

Ma等[20]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高氧組早產(chǎn)兒動(dòng)物模型Nrf2和HO-1基因和蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，并且發(fā)現(xiàn)BPD患兒的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性與對(duì)照組有顯著差異。Lin等[21]研究表明，Nrf2/HO-1軸可能在氣體遞質(zhì)對(duì)BPD的保護(hù)作用中起核心作用。McGrath-Morrow等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2能夠增加新生小鼠暴露于高氧的存活率，并且Nrf2可能有助于減輕高氧暴露引起的肺泡生長(zhǎng)抑制。

以上研究驗(yàn)證了Nrf2在BPD中的保護(hù)作用，提示Nrf2在BPD的防治方向上的巨大潛力。

3 以Nrf2為靶點(diǎn)治療BPD及其相關(guān)藥物的研究進(jìn)展

Nrf2轉(zhuǎn)錄因子對(duì)細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)至關(guān)重要，而Keap1作為一種Nrf2信號(hào)的內(nèi)源性抑制劑，會(huì)抑制這些保護(hù)反應(yīng)。暴露于高氧的Nrf2充足(野生型)新生小鼠出現(xiàn)肺泡發(fā)育不良，這一現(xiàn)象與人類BPD病相似，Nrf2缺乏使其惡化。Tamatam等[23]使用了帶有亞型Keap1 floxed等位基因(Keap1)且Nrf2水平增加的生后1d(PND1)幼鼠，以檢驗(yàn)早產(chǎn)肺中Nrf2的組成水平不足以減輕高氧誘導(dǎo)的肺泡發(fā)育不良的假設(shè)，Keap1幼鼠不伴有肺泡生長(zhǎng)抑制且抗氧化基因和谷胱甘肽表達(dá)水平增加，Keap1敲除導(dǎo)致出生后肺細(xì)胞增殖上調(diào)，但在高氧后有相反的作用。這項(xiàng)研究表明，通過(guò)靶向Keap1來(lái)增強(qiáng)內(nèi)源性Nrf2的激活，可能提供了一種防治BPD的生理學(xué)方法。

Zhao等[24]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，自噬激動(dòng)劑雷帕霉素可以通過(guò)抑制p62磷酸化，促進(jìn)Keap1降解，增加Nrf2核轉(zhuǎn)運(yùn)，增加下游抗氧化酶表達(dá)，增強(qiáng)抗氧化能力，從而改善BPD大鼠肺泡結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)化。這提示使用自噬激動(dòng)劑來(lái)增強(qiáng)Nrf2-ARE通路活性并促進(jìn)肺泡發(fā)育，可能是BPD抗氧化治療的新靶點(diǎn)[25]。

Cho等[26]利用新生Nrf2缺陷型[Nrf2(-/-)]和野生型[Nrf2(+/+)]小鼠，研究了Nrf2介導(dǎo)的分子事件在囊狀到肺泡型肺成熟過(guò)程中的作用，以及Nrf2在高氧性肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用。與Nrf2(+/+)新生兒相比，Nrf2(-/-)新生兒肺組織細(xì)胞周期、氧化還原平衡和脂質(zhì)/碳水化合物代謝基因的基礎(chǔ)表達(dá)降低，而淋巴細(xì)胞免疫基因高表達(dá)，在Nrf2(-/-)新生兒中，高氧誘導(dǎo)的表型，包括死亡率、囊泡期向肺泡期轉(zhuǎn)變的停止、肺水腫、伴隨DNA損傷和組織氧化的炎癥明顯比Nrf2(+/+)新生兒嚴(yán)重，新生兒期Nrf2缺乏加重了新生兒高氧所致的肺損傷和肺泡化的抑制。這提示了特異性Nrf2激活劑對(duì)包括BPD在內(nèi)的氧化應(yīng)激相關(guān)新生兒疾病有治療潛力。

Dunigan等[27]研究了硫氧還蛋白還原酶-1(TXNRD1)抑制劑誘導(dǎo)HO-1的機(jī)制，HO-1被認(rèn)為是ARDS和BPD的潛在治療靶點(diǎn)。TXNRD1主要在氣道上皮細(xì)胞表達(dá)，可有效激活Nrf2反應(yīng)，減輕肺損傷，當(dāng)TXNRD1被抑制時(shí)，HO-1與Nrf2靶標(biāo)NADPH醌氧化還原酶-1(NQO1)不呈比例地增加，提示Nrf2是TXNRD1抑制劑增加肺上皮細(xì)胞HO-1的主要機(jī)制，可以成為BPD的治療靶點(diǎn)。

DL-3-正丁基苯酞(NBP)是由L-3-正丁基苯酞合成的外消旋體，Gong等[28]探討NBP對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷(ALI)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NBP可明顯抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺濕干比升高、肺組織損傷、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、促炎細(xì)胞因子和趨化因子的釋放以及氧化損傷，可增加脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺組織sirtuin1(SIRT1)和Nrf2的表達(dá)，結(jié)果表明，NBP能以SIRT1依賴和SIRT1非依賴的方式激活Nrf2抗氧化信號(hào)，從而減輕氧化應(yīng)激、炎癥和肺水腫，即有望達(dá)到治療BPD的目的。

新生大鼠的肺對(duì)應(yīng)于肺發(fā)育的囊狀階段和青春期前的人肺發(fā)育階段，表現(xiàn)為總谷胱甘肽和過(guò)氧化氫增加，DNA和脂質(zhì)氧化損傷，以及對(duì)高氧反應(yīng)的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)第二階段介質(zhì)(超氧化物歧化酶、血紅素氧合酶-1和Nrf2/Keap1系統(tǒng))的誘導(dǎo)。Endesfelder等[29]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，除了腺苷受體的藥理拮抗作用外，咖啡因可能是一種有效的抗氧化劑，其減少氧化脫氧核糖核酸損傷，對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)有保護(hù)性干擾，并調(diào)節(jié)高氧誘導(dǎo)的肺氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而在BPD相關(guān)動(dòng)物模型中具有保護(hù)作用。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在許多人類疾病的治療中有著廣闊的前景，其具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化活性，胎兒來(lái)源的人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(HfPMSCs)具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。Yan等[30]采用hfPMSCs的細(xì)胞共培養(yǎng)模型和條件培養(yǎng)液(CM)，通過(guò)檢測(cè)hfPMSCs清除氧化劑和自由基的能力以及保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞免受抗氧化損傷的能力來(lái)檢測(cè)hfPMSCs的抗氧化活性，結(jié)果表明，100 μM的維生素C具有一定的抗氧化能力，在單層和跨孔共培養(yǎng)模型中，CM單獨(dú)和共培養(yǎng)的hfPMSCs均顯示出保護(hù)A549肺泡上皮細(xì)胞免受600 μM過(guò)氧化氫(H2O2)暴露的氧化損傷的作用，與單純對(duì)照組相比，hfPMSCs及其CM可顯著降低HO誘導(dǎo)的肺泡上皮A549細(xì)胞的凋亡率，同時(shí)增加抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1、NRF-2和HO-1的表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax、caspase 3和Keap1的表達(dá)。此外，從培養(yǎng)的hfPMSCs-CM中發(fā)現(xiàn)Nrf2/Keap1/ARE信號(hào)通路被抑制，導(dǎo)致A549細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)顯著降低，盡管加入Nrf2抑制劑ML385，仍對(duì)hfPMSCs-CM的抗氧化活性沒(méi)有影響。這些研究數(shù)據(jù)表明，hfPMSCs至少部分地通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)HO誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷。

另外，小干擾RNA(siRNA)可抑制A549細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，抑制miR-125b的表達(dá)，并顯著增加細(xì)胞凋亡率，提示miR-125b作為Nrf2的下游靶點(diǎn)有助于保護(hù)BPD[20]。McGrath-Morrow等[31]發(fā)現(xiàn)，Nrf2的激活提高了高氧暴露下新生小鼠的存活率，這可能是由于抗氧化反應(yīng)基因的表達(dá)增加所致，盡管Nrf2的激活誘導(dǎo)了抗氧化基因的表達(dá)，但并不能減輕暴露于高氧所致的肺泡生長(zhǎng)停滯。

4 Nrf2及其相關(guān)藥物在其他疾病中的應(yīng)用

Zheng等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松治療哮喘的機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2通路，從而抑制哮喘小鼠肺部氧化應(yīng)激水平。Keap1-Nrf2通路可以影響下游抗氧化反應(yīng)元件的表達(dá)。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑對(duì)體內(nèi)細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制作用可能的潛在機(jī)制是激活Keap1/Nrf2信號(hào)通路。

質(zhì)膜結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體(TGR5)可通過(guò)促進(jìn)Keap1-Nrf2信號(hào)通路的激活，有效減輕肝臟缺血再灌注損傷時(shí)的炎癥反應(yīng)，在多種肝病中起保護(hù)作用，這可能在減少相關(guān)炎癥分子、調(diào)節(jié)固有免疫方面有一定意義[33]。

槐苷(SOP)是從槐籽中分離得到的一種異黃酮苷，具有抗癌、抗過(guò)敏、抗炎等多種藥理活性，Wu等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，SOP以AMPK/Nrf2依賴的方式減輕LPS誘導(dǎo)的ALI，提示SOP可能是治療ALI/ARDS的潛在候選藥物。

Ali等[35]探討了馬兜鈴酸(CNT)在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中的抗炎作用，CNT誘導(dǎo)Nrf2蛋白的表達(dá)，分子對(duì)接研究顯示，其與Nrf2、P65、Keap1、HO-1、IL-1β、IL-6、TNF-α和COX-2有顯著的結(jié)合作用，并表現(xiàn)出良好的物理化學(xué)性質(zhì)，CNT對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺損傷有明顯的保護(hù)作用，并能改善動(dòng)物的行為、生化和組織學(xué)指標(biāo)。

研究顯示，Nrf2依賴基因Pparg可編碼過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)[36]，PPARγ可對(duì)抗炎癥引發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白，在調(diào)節(jié)基因介入的炎癥反應(yīng)中至關(guān)重要，而PPARγ的表達(dá)取決于 Nrf2。研究證實(shí)，抑制小窩蛋白酪氨酸殘基14磷酸化可增加Nrf2的核內(nèi)表達(dá)，從而增加其效應(yīng)分子PPARγ及claudin-5的表達(dá)，這對(duì)減輕肺組織炎癥、降低肺毛細(xì)血管旁滲透性具有十分重要的意義。

吳燦等[37]研究顯示，銀杏內(nèi)酯B對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化具有明顯的防治作用,其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1和Bcl-2/Bax途徑發(fā)揮作用，提示Nrf2在減輕大鼠肝纖維化方面的意義。

此外，Nrf2為腎臟疾病、肝臟疾病、心腦血管疾病、風(fēng)濕疾病等諸多疾病的治療提供新的治療靶點(diǎn)[38-45]。其激活藥物富馬酸二甲酯目前在多發(fā)性硬化癥的治療中被批準(zhǔn)應(yīng)用[46]。

5 展望

綜上所述，很多研究證實(shí)了Nrf2及其通路在BPD的作用，有望提供新的治療靶點(diǎn)，但是目前研究尚不充分,且停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平，需要進(jìn)一步的研究來(lái)證明Keap1/Nrf2信號(hào)通路在BPD的潛在機(jī)制。Nrf2已成為一個(gè)重要的預(yù)防和治療靶點(diǎn)，許多天然和合成化學(xué)物質(zhì)被認(rèn)為是其調(diào)節(jié)劑,然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明,Keap1-Nrf2-ARE調(diào)節(jié)的復(fù)雜程度遠(yuǎn)超于此，并且還涉及其他分子機(jī)制[10]。Nrf2在新生兒疾病領(lǐng)域的研究尚且不足，Nrf2和Keap1的表觀遺傳調(diào)控將成為未來(lái)研究的一個(gè)重要方向。我們需要更多的研究對(duì)目前可用的Nrf2誘導(dǎo)劑和抑制劑進(jìn)行嚴(yán)格評(píng)估，探索Nrf2及其通路的調(diào)控措施，探索更成熟易檢測(cè)的標(biāo)志物，以期能夠增加BPD的治療靶點(diǎn)。