逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

畢建云，張 靜，趙云濤，劉文靜，孫 玉，劉雅楠

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新研究院，山東 濟(jì)南 250355；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355）

中藥凝膠貼膏[1-2]因載藥量大，含水量高，刺激性小，生物相容性好，使用方便等優(yōu)勢(shì)，是繼口服、注射給藥系統(tǒng)之后很有發(fā)展?jié)摿Φ闹兴幗o藥系統(tǒng)之一，近年成為外用制劑研發(fā)的熱點(diǎn)[3]?，F(xiàn)對(duì)傳統(tǒng)中藥煎劑進(jìn)行劑型改良，將血府逐瘀湯劑[4-5]制成一種透氣性好、貼敷舒適的新型經(jīng)皮給藥劑型——逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼，滿足中藥制劑現(xiàn)代化生產(chǎn)的要求[6]。在熱敷條件下，可促進(jìn)中藥組方中有效成分的透皮吸收，能有效改善血液循環(huán)、可用于治療痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后惡露不絕、腰腹疼痛等婦科常見(jiàn)病、多發(fā)病?，F(xiàn)對(duì)該制劑進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型液相儀（日本島津），檢測(cè)器為SPD-20A紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，泵為L(zhǎng)C-20AT，工作站：LC-Solution；FA2004B電子天平（賽多利斯）；ZOLLO-650CT型多功能恒溫超聲波提取器（上海左樂(lè)），ZF-1型三用紫外燈分析儀（杭州奇威）。

1.2 試藥

硅膠G（青島海洋化工）；乙酸乙酯，甲醇，乙醇等所用試劑均為分析純，乙腈為色譜純，供含量測(cè)定用；桔梗（批號(hào)：121028-201612），川芎（批號(hào)：120918-201813），當(dāng)歸（批號(hào)：120927-201617），枳殼（批號(hào)：120981-201605），牛膝（批號(hào)：121066-201809），供薄層鑒別用，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；芍藥苷（批號(hào)：FY1265VX53J，供含量測(cè)定用，南通飛宇）；苦杏仁苷（批號(hào)為110736-201842，供含量測(cè)定用，上海經(jīng)科）；藁本內(nèi)酯（批號(hào)為181216，供含量測(cè)定用，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；逐淤止痛遠(yuǎn)紅外灸貼共3批（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室研制，批號(hào)為20191206，20191210，20191214）。

2 方法和結(jié)果

2.1 桔梗鑒別[7]

2.1.1 供試品溶液制備 取16.5 g藥膏，剪碎，加入3 ml鹽酸、30 ml水，加熱回流1 h，冷卻濾過(guò)，濾液用乙酸乙酯提取2次，每次50 ml，合并乙酸乙酯，蒸干，1 ml甲醇溶解，即得。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液制備 取0.5 g桔梗對(duì)照藥材，同供試品溶液的制備方法制得桔梗對(duì)照藥材溶液。

2.1.3 空白對(duì)照液制備 按處方比例稱取除桔梗的剩余藥材共6.8 g，采用逐淤止痛遠(yuǎn)紅外灸貼的制備方法制備缺桔梗的貼片，采用供試品制備方法制得缺桔梗的空白對(duì)照液。

2.1.4 TLC實(shí)驗(yàn)及結(jié)果 吸取空白對(duì)照液8 μl，供試品溶液8，10 μl；對(duì)照藥材溶液6，10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷:乙醚（3:1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品與對(duì)照藥材特征斑點(diǎn)明顯，空白對(duì)照相應(yīng)位置無(wú)斑點(diǎn)，表現(xiàn)了該法良好的重現(xiàn)性、專屬性和層析效果，見(jiàn)圖1。

圖1 桔梗的TLC鑒別

2.2 牛膝鑒別

2.2.1 供試品溶液制備 取所制備貼膏22 g，剪碎，加50 ml甲醇，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干。殘?jiān)?0 ml水溶解，加入50 %乙醇和1 ml稀鹽酸，搖勻。用無(wú)水乙醚振搖提取2次，每次25 ml，合并乙醚提取液（備用），取下層酸水溶液，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 ml，合并正丁醇提取液；用氨試液洗滌兩次，每次20 ml，棄去氨試液，蒸干正丁醇，殘?jiān)? ml甲醇使溶解，即得。

2.2.2 對(duì)照藥材溶液制備 取1 g牛膝對(duì)照藥材，同供試品溶液的制備方法制得牛膝對(duì)照藥材溶液。

2.2.3 空白對(duì)照液制備 按處方比例稱取除牛膝的剩余藥材共7.12 g，采用逐淤止痛遠(yuǎn)紅外灸貼的制備的方法制備缺牛膝的貼片，采用供試品的制備方法制備缺牛膝的空白對(duì)照液。

2.2.4 TLC實(shí)驗(yàn)及結(jié)果 吸取空白供試品溶液6 μl，供試品溶液8，10 μl；對(duì)照藥材溶液6，10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷:甲醇（10:1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干；在紫外燈（365 nm）下檢視，若不清晰，噴10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃烘干10 min，在紫外燈（365 nm）下檢視。供試品與對(duì)照藥材在同一位置有相同的斑點(diǎn)，空白對(duì)照處無(wú)斑點(diǎn)，且層析各斑點(diǎn)分離明顯，表明該法層析分離、重現(xiàn)性和專屬性均較好，見(jiàn)圖2。

圖2 牛膝的TLC鑒別

2.3 川芎、當(dāng)歸鑒別

2.3.1 供試品溶液制備 取2.2.1中備用的乙醚溶液，用水洗滌兩次，每次25 ml，棄去水洗液，蒸干乙醚，殘?jiān)? ml甲醇使溶解，即得。

2.3.2 對(duì)照藥材溶液制備 取當(dāng)歸、川芎對(duì)照藥材各1 g，同供試品溶液的制備方法制得當(dāng)歸、川芎對(duì)照藥材溶液。

2.3.3 空白對(duì)照液制備 按處方比例稱取除牛膝的剩余藥材共7.06 g，采用逐淤止痛遠(yuǎn)紅外灸貼的制備的方法制備缺川芎、當(dāng)歸的貼片，采用供試品的制備方法值得缺川芎、當(dāng)歸的空白對(duì)照液。

2.3.4 TLC實(shí)驗(yàn)及結(jié)果 吸取空白供試品溶液4 μl，供試品溶液4，8 μl；對(duì)照藥材溶液各1 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷:乙酸乙酯（9:1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干；在紫外燈（365 nm）下檢視。供試品與對(duì)照品存在相同的特征斑點(diǎn)，空白對(duì)照處無(wú)可見(jiàn)斑點(diǎn)，各斑點(diǎn)分離明顯，該法重現(xiàn)性和專屬性均較好，見(jiàn)圖3。

圖3 川芎、當(dāng)歸的TLC鑒別

2.4 枳殼鑒別

2.4.1 供試品溶液制備 取24 g所制備貼膏，剪碎，加40 ml甲醇沒(méi)過(guò)，超聲提取1h，靜置2h，濾過(guò)，濾液濃縮至稠狀，殘?jiān)?0 ml水溶解，加50 %乙醇10 ml、1 ml稀鹽酸，搖勻。用乙醚振搖提取兩次，每次25 ml，棄去乙醚液，保留酸水溶液；用乙酸乙酯振搖提取兩次，每次25 ml，合并乙酸乙酯提取液。用水洗滌兩次，棄去水洗液。蒸干乙酸乙酯，殘?jiān)? ml甲醇使溶解，即得。

2.4.2 對(duì)照藥材溶液制備 取1 g枳殼對(duì)照藥材，加10 ml甲醇，超聲提取0.5 h，濾過(guò)，即得。

2.4.3 空白對(duì)照液制備 按處方比例稱取除枳殼的剩余藥材共11.16 g，采用逐淤止痛遠(yuǎn)紅外灸貼的制備方法制備缺枳殼的貼片，采用供試品的制備方法制得缺枳殼的空白對(duì)照液。

2.4.4 TLC實(shí)驗(yàn)及結(jié)果 吸取空白供試品溶液6 μl，供試品溶液6，8 μl；對(duì)照藥材溶液2，4 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷:甲醇水（13:6:2）下層為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干；在紫外燈（365 nm）下檢視，若不清晰，噴三氯化鋁乙醇試液，105 ℃烘干10 min，在紫外燈（365 nm）下檢視。供試品與對(duì)照品相同的位置有相同的斑點(diǎn)，空白對(duì)照處無(wú)可見(jiàn)斑點(diǎn)，該法層析分離效果良好，重現(xiàn)性和專屬性均較好，見(jiàn)圖4。

圖4 枳殼的TLC鑒別

2.5 HPLC含量測(cè)定[8-10]

2.5.1 供試品溶液制備 取重量差異下的所制備貼膏1貼，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇 50 ml，稱定重量，水浴加熱回流1 h，再稱定重量，用50 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心5 min，取上清，即得。

2.5.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品配成濃度為0.25 mg/ml對(duì)照品溶液；精密稱取苦杏仁苷對(duì)照品，配成濃度為0.6 mg/ml對(duì)照品溶液；精密稱取藁本內(nèi)酯對(duì)照品，配成濃度為0.1 mg/ml對(duì)照品溶液。

2.5.3 色譜條件 芍藥苷：色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1 %磷酸（15:85）；流速1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；進(jìn)樣量10 μl；柱溫30 ℃。

苦杏仁苷：色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（20:80）；流速1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量10 μl；柱溫30 ℃。

藁本內(nèi)酯：色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（80:20）；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm；進(jìn)樣量10 μl；柱溫 25 ℃。

2.5.4 方法學(xué)考察

2.5.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取2.5.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，2.5.2項(xiàng)下供試品溶液各10 μl，按2.5.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，樣品中芍藥苷、苦杏仁苷和藁本內(nèi)酯分別在19，25和9 min處有較好峰形，表明方法專屬性良好，見(jiàn)圖5～13。

圖5 芍藥苷對(duì)照品HPLC圖譜

圖6 芍藥苷樣品HPLC圖譜

圖7 芍藥苷空白對(duì)照HPLC圖譜

圖8 苦杏仁苷對(duì)照品HPLC圖譜

圖9 苦杏仁苷樣品HPLC圖譜

圖10 苦杏仁苷空白對(duì)照HPLC圖譜

圖11 藁本內(nèi)酯對(duì)照品HPLC圖譜

圖12 藁本內(nèi)酯樣品HPLC圖譜

圖13 藁本內(nèi)酯空白對(duì)照HPLC圖譜

2.5.4.2 線性關(guān)系考察 芍藥苷：精密移取不同濃度的芍藥苷對(duì)照品10 μl，進(jìn)樣量分別為1.25，2.5，5，6.25，8.75 μg，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程Y=934 809.43X+21 153.95，r=0.9999。

苦杏仁苷：精密移取不同濃度的苦杏仁苷對(duì)照品各10 μl，進(jìn)樣量分別為0.3，0.6，1.2，1.5，1.8 μg，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程Y=5 135 869.50X-85 728.90，r=0.9996。

藁本內(nèi)酯：精密移取不同濃度的苦杏仁苷對(duì)照品各10 μl，進(jìn)樣量分別為0.26，0.66，1.31，2.63，3.82，3.94 μg，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程Y=457 219.36X-506.22，r=0.9999。

2.5.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.5.2所制備的對(duì)照品溶液各10 μl，按2.5.3項(xiàng)下色譜條件，分別重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。芍藥苷、苦杏仁苷和藁本內(nèi)酯峰面積值的RSD分別為1.23 %，1.11 %和0.5 %（n=6），結(jié)果表明，儀器精密度較好。

2.5.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取2.5.1項(xiàng)下供試品溶液各10 μl，分別在0，2，4，8，12和24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。得芍藥苷、苦杏仁苷和藁本內(nèi)酯峰面積值的RSD分別為1.48 %，1.98 %和1.58 %（n=6），結(jié)果表明，供試品溶液24 h內(nèi)的穩(wěn)定性較好。

2.5.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一時(shí)間用同批號(hào)原料制備的貼膏，按2.5.1項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.5.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各組分的含量，樣品提取液中芍藥苷、苦杏仁苷和藁本內(nèi)酯的平均含量分別為0.380，0.131和0.0295 mg/ml，RSD分別為1.83 %，1.89 %和1.18 %（n=6），結(jié)果表明，方法的重復(fù)性較好。

2.5.4.6 加樣回收率 取逐淤止痛灸貼0.5帖6份，剪碎，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分別加入芍藥苷對(duì)照品9.78 mg，苦杏仁苷對(duì)照品約3.3 mg，藁本內(nèi)酯對(duì)照品約0.74 mg，按2.5.1項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.5.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得芍藥苷的平均加樣回收率為98.49 %，RSD=1.93 %（n=6），苦杏仁苷的平均加樣回收率為97.8 %，RSD=1.29 %（n=6），藁本內(nèi)酯的平均加樣回收率為96.99 %，RSD=1.46 %（n=6）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5.5 樣品含量測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與3批供試品溶液各10 μl ，注入高效液相色譜儀測(cè)定，計(jì)算各批樣品中芍藥苷、苦杏仁苷、藁本內(nèi)酯的含量，結(jié)果見(jiàn)表2 。

表1 芍藥苷、苦杏仁苷、藁本內(nèi)酯加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 芍藥苷的含量測(cè)定

3 結(jié)論

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼中牛膝、川芎、當(dāng)歸、桔梗和枳殼的薄層鑒別方法，方法簡(jiǎn)便易行、準(zhǔn)確可靠；采用芍藥苷、苦杏仁苷和藁本內(nèi)酯多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法，使所得該膏劑的指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)控制更加全面，專屬性、重復(fù)性較好，精密度高。故本文建立的定性定量方法可作為逐瘀止痛遠(yuǎn)紅外灸貼的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。