馬鈴薯S病毒RT-qPCR通用檢測體系的建立與應(yīng)用

程勝群，呂文河，高艷玲,，白艷菊，范國權(quán)，張 威，張 抒，邱彩玲，申 宇，董學(xué)志，白雅梅

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 馬鈴薯研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

作為中國第四大糧食作物，馬鈴薯產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富，在確保糧食安全方面具有重要作用[1]。預(yù)計到2020年馬鈴薯種植面積可以擴(kuò)大到667萬 hm2[2]。但由于病毒病的危害，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。侵染馬鈴薯的病毒大約有40種[3]，馬鈴薯S病毒(PotatovirusS, PVS)是影響全球馬鈴薯生產(chǎn)僅次于馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY, PVY)和馬鈴薯卷葉病毒(Potatoleafrollvirus, PLRV)的第三大病毒[4]。2004-2009年，PVS在中國馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)大田種薯的檢出率為0.32%～19.80%，僅次于PVY[5-8]，帶毒率由北向南呈增高趨勢[9]。

PVS屬于乙型線形病毒科(Betaflexviridae)香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)[10]，是長610～710 nm的彎曲線狀粒子，正單鏈RNA(+ssRNA)長8.4～8.5 kb[11]。PVS于1948年在荷蘭首次發(fā)現(xiàn)[12]，遺傳進(jìn)化分析表明，PVS起源于南美，后被引入歐洲并擴(kuò)展為主要傳播中心[13]，目前廣泛分布于美國、英國、荷蘭、伊朗等馬鈴薯產(chǎn)區(qū)[14]。根據(jù)PVS侵染昆諾瓦藜(Chenopodiumquinoa)的癥狀可將其分為PVSO(Ordinary strain)和PVSA(Andean strain)株系[9]，其中，PVSO侵染后昆諾瓦藜表現(xiàn)局部枯斑，而PVSA株系則表現(xiàn)為系統(tǒng)侵染。Cox等[15]發(fā)現(xiàn)并建議將昆諾瓦藜表現(xiàn)系統(tǒng)侵染但與PVSO遺傳關(guān)系較近的分離株命名為PVSO-CS(CS=Chenopodiumsystemic)。并建議將來使用PVSA-CL(CL=Chenopodiumlocalized)代表不能系統(tǒng)侵染昆諾瓦藜但與PVSA遺傳關(guān)系較近的分離株。2018年，歐洲發(fā)現(xiàn)5個PVS重組分離株，其中1個為PVSA-CL[16]。此外，PVS分離株RVC在全序列遺傳進(jìn)化樹中既不屬于PVSO，又不屬于PVSA，可能代表了一種新的PVS株系[11]。目前，PVSO和PVSA在中國內(nèi)蒙古、黑龍江、遼寧、河北、山東、青海、廣西、湖南、四川、浙江、福建、貴州等地均有報道[17]。

PVS可通過機(jī)械摩擦和蚜蟲傳播，種植在田間的馬鈴薯原種能迅速感染PVS，一個生產(chǎn)季后感染率可達(dá)70%[18]。黃萍等[19]對大西洋原原種連續(xù)繁種的生產(chǎn)試驗(yàn)進(jìn)行4種病毒檢測，PVS的檢出率最高，種植1 a后帶毒率為3%，種植3 a后帶毒率高達(dá)30%。PVS在大多數(shù)馬鈴薯品種中癥狀不明顯[9]，只在易感品種中表現(xiàn)葉脈深陷、葉片皺縮、小的壞死斑點(diǎn)等癥狀[20]。與PVSO相比，PVSA能引起更嚴(yán)重的癥狀[21]，在指示植物昆諾瓦藜中引起系統(tǒng)壞死斑[9]。PVS與其他病毒復(fù)合侵染時可加劇馬鈴薯癥狀[22]，如PVS與馬鈴薯X病毒(PotatovirusX, PVX)復(fù)合侵染可增加植株中PVS的濃度，導(dǎo)致馬鈴薯出現(xiàn)重花葉癥狀[23]。PVS單獨(dú)侵染導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)10%～20%[24]，而與其他病毒復(fù)合侵染時可增至30%[22]。由于PVS單獨(dú)侵染在馬鈴薯上引起的癥狀較輕，因此在種薯生產(chǎn)中難以防控。2004-2009年，在試管苗中檢出率最高，為18.94%～36.69%[5-8,19]，這可能與PVS在莖尖脫毒中比較難以脫除有關(guān)[25-26]。試管苗是脫毒種薯生產(chǎn)的源頭，因此，在種薯生產(chǎn)中對莖尖剝離材料、試管苗、原種及各級種薯進(jìn)行PVS檢測具有重要意義。

目前，常規(guī)檢測病毒的方法有雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(Double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay, DAS-ELISA)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)、實(shí)時熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR, RT-qPCR)等。DAS-ELISA法適合檢測葉片組織，但存在耗時長、靈敏度低等問題，而RT-qPCR方法靈敏度高，是常規(guī)RT-PCR法的10倍以上[27]。此外，RT-qPCR方法還具有操作簡單，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。目前，已經(jīng)建立了PVX[28]、PVY[29]、PVS[30]、馬鈴薯A病毒(PotatovirusA, PVA)和PLRV[31]的RT-qPCR檢測體系。

RT-qPCR法自出現(xiàn)以來，已廣泛應(yīng)用于病毒、真菌、轉(zhuǎn)基因等檢測及遺傳育種領(lǐng)域[32]。但隨著GenBank中PVS序列逐漸增多，PVS顯示出豐富的遺傳多樣性，現(xiàn)有PVS檢測引物不能與之高度匹配，未能檢出一些特殊株系和未分株系。本試驗(yàn)比對分析了NCBI GenBank中現(xiàn)有PVS序列，設(shè)計PVSO和PVSA的通用引物，并可根據(jù)擴(kuò)增片段熔解溫度(Melting temperature, Tm)鑒定2種株系。此外，通過構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線并測試檢測體系靈敏度，測定感染PVS的馬鈴薯葉片、葉柄、莖、根和休眠塊莖中病毒含量，確定適合檢測的馬鈴薯組織類型，尤其是休眠塊莖。本研究旨在建立一套快速、準(zhǔn)確的PVS RT-qPCR檢測體系，并可方便快捷的鑒定PVSO和PVSA株系。可直接檢測馬鈴薯休眠塊莖等不同部位的樣品，為莖尖脫毒材料篩選、試管苗病毒篩查、脫毒種薯生產(chǎn)等提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試毒源及植物：感染PVSO的馬鈴薯品種尤金試管苗G89和感染PVSA的試管苗G93，以及分別感染 PVX、PVY、馬鈴薯M病毒(PotatovirusM, PVM)、PVA 和 PLRV 的馬鈴薯試管苗G84、G87、G98、G35和G76，均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所保存。健康馬鈴薯試管苗G1亦由該所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物總RNA的提取及cDNA的合成 RNA的提取：分別切取馬鈴薯試管苗G89、G93、G84、G87、G98、G35和G76和健康試管苗G1的莖葉100 mg，放于-20 ℃預(yù)冷的研缽中，加入液氮充分研磨后迅速轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，加入1 mL TRIzol，按照TRIzol試劑說明書方法提取后的植物總RNA放于-80 ℃冰箱保存。

cDNA合成：取4 μL RNA、1 μL隨機(jī)引物、5 μL DNA/RNA酶去離子水，70 ℃預(yù)變性5 min，冰上放置2 min。依次加入5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液5 μL、10 mmol/L dNTP 1.25 μL、40 U/μL RNA酶抑制劑 0.5 μL、200 U/μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL、無DNA/RNA酶去離子水7.25 μL。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?7 ℃ 1 h，92 ℃ 5 min。合成的cDNA保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 RT-qPCR檢測體系的建立 引物設(shè)計：下載NCBI數(shù)據(jù)庫GenBank中所有PVS序列，應(yīng)用軟件BIo-edit進(jìn)行比對分析后，以來自中國的PVSO分離株HB24(GenBank登錄號為 KU896945)和PVSA分離株HB7(GenBank登錄號為KU896946)為模板，應(yīng)用Primer 5.0在保守區(qū)域CP(Coat protein，CP)基因處設(shè)計引物，PVS-F序列為5′-AAAGTGTG CAGGCTGTATGC-3′，在兩序列上位置為7 761～7 780 bp，PVS-R序列為5′-ATCTCAGCGCCRAGC AT-3′，在兩序列上位置為8 046～8 062 bp，擴(kuò)增目的片段長度為302 bp，PVSO株系目的片段Tm理論值為88.9 ℃，PVSA株系Tm理論值為89.7 ℃，相差0.8 ℃。引物合成及序列測定委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

RT-qPCR 20 μL反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL、Eva-Green 1 μL、5 U/μLTaq酶 0.12 μL、cDNA 2 μL，用無DNA/RNA酶去離子水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 15 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，采集熒光信號，40個循環(huán)；60～95 ℃分析熔解曲線。實(shí)時熒光定量PCR儀型號為Roche LightCycler? 480。

1.2.3 RT-qPCR特異性檢測 馬鈴薯試管苗G89、G93、G84、G87、G98、G35和G76的cDNA為模板，以無DNA/RNA酶去離子水為空白對照，健康試管苗G1的cDNA為陰性對照進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，根據(jù)熔解曲線判斷有無非特異擴(kuò)增。

1.2.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和靈敏度檢測 以馬鈴薯試管苗G89和G93的cDNA為模板，以PVS-F和PVS-R為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min, 4 ℃ 5 min。經(jīng)1.5% 瓊脂糖電泳檢測后回收PCR產(chǎn)物，與pESI-T載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用RT-PCR法鑒定陽性克隆，應(yīng)用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒并測序。質(zhì)?？截悢?shù)=6.02×1023×質(zhì)粒濃度(g/μL)/(載體長度+片段長度)×660，式中6.02×1023為阿佛伽德羅常數(shù)，載體長度為1 865 bp，片段長度為302 bp，用紫外分光光度計測試重組質(zhì)粒濃度，計算得到拷貝數(shù)，將重組質(zhì)粒按照拷貝數(shù)進(jìn)行10倍梯度稀釋成標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，每個模板3次重復(fù)，以起始模板數(shù)的對數(shù)為X軸，熒光信號基線的循環(huán)數(shù)平均值(Cycle threshold，Ct值)為Y軸作回歸曲線，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋成8個濃度梯度檢測靈敏度，同時進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，測定檢測靈敏度。

1.2.5 田間馬鈴薯樣品檢測 馬鈴薯樣品隨機(jī)采自黑龍江、吉林、遼寧、河北、陜西、四川、云南、貴州、廣東、重慶、內(nèi)蒙古11個省(市、自治區(qū))的馬鈴薯生產(chǎn)田，應(yīng)用PVS DAS-ELISA檢測試劑盒檢測，篩選90份PVS陽性樣品，用所建的RT-qPCR檢測體系進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.6 馬鈴薯植株5個部位PVS含量測定 馬鈴薯品種尤金和冀張薯12號原種種植于溫室盆缽中，株高20 cm時，分別接種PVSO和PVSA毒源樣品G89和G93。接種30 d后，采集馬鈴薯葉片、葉柄、莖和根，分別在上述部位取100 mg組織，液氮處理后提取植物總RNA。收獲后，采集馬鈴薯休眠塊莖提取總RNA，5個部位RNA用水稀釋到100 ng/μL。應(yīng)用PVS RT-qPCR檢測體系進(jìn)行檢測，根據(jù)所建的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定各部位PVS含量。對2個品種尤金和冀張薯12號分別進(jìn)行統(tǒng)計分析，按二因素(PVS株系和不同部位)完全隨機(jī)設(shè)計實(shí)施，3次重復(fù)，采用新復(fù)極差法進(jìn)行處理平均值的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-qPCR檢測體系的建立

PVSO分離株G89和PVSA分離株G93擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物熔解曲線溫度為60～95 ℃，分別在85.77～86.00 ℃和87.78～87.91 ℃出現(xiàn)特異熔解峰，Tm值不同，平均數(shù)相差1.99 ℃(圖1)。

左側(cè)85.77～86.00 ℃為樣品G89的熔解峰；右側(cè)87.78～87.91 ℃為樣品G93的熔解峰。

2.2 特異性檢測

PVSO馬鈴薯試管苗G89擴(kuò)增后熔解曲線在86.72 ℃出現(xiàn)特異峰，PVSA馬鈴薯試管苗G93擴(kuò)增后熔解曲線在88.05 ℃出現(xiàn)特異峰；而感染PVX、PVY、PVM、PVA和PLRV的陽性樣品，以及陰性對照和空白對照擴(kuò)增后未出現(xiàn)此特異熔解峰(圖2)，說明該體系特異性好。在78.03 ℃出現(xiàn)的較低熔解峰為引物二聚體的熔解峰，與特異熔解峰相距較遠(yuǎn)，不影響結(jié)果判讀。

左側(cè)86.72 ℃為G89的熔解峰；右側(cè)88.05 ℃為G93的熔解峰；在86～89 ℃無熔解峰的樣品為G84、G87、G98、G35、G76、G1和水。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及靈敏度檢測

PVSO、PVSA重組質(zhì)粒濃度分別為26.00，29.86 ng/μL，經(jīng)計算PVSO拷貝數(shù)為1.09×1010拷貝/μL，PVSA拷貝數(shù)為1.26×1010拷貝/μL。PVSO、PVSA起始模板量的對數(shù)值與Ct值的線性關(guān)系見圖3，4，PVSO質(zhì)粒濃度在1.09×105～1.09×109拷貝/μL間呈明顯的線性關(guān)系，Y=-3.459lgX+37.94(決定系數(shù)為R2=0.994 2)，熔解曲線在85.93 ℃出現(xiàn)特異峰；PVSA質(zhì)粒濃度在1.26×105～1.26×109拷貝/μL間呈明顯的線性關(guān)系，Y=-3.522lgX+40.20(決定系數(shù)為R2=0.991 2)，熔解曲線在87.91 ℃出現(xiàn)特異峰，其中X為模板拷貝數(shù)，Y為樣品循環(huán)數(shù)，Ct值與DNA拷貝數(shù)對數(shù)之間的線性關(guān)系良好，2個重組質(zhì)粒作為熒光定量PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)品是合格的。分別以PVSO、PVSA稀釋后的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板檢測靈敏度，結(jié)果表明，靈敏度分別為1.09×103，1.26×103拷貝/μL(圖5，6)，常規(guī)PCR可檢測1.09×105，1.26×105拷貝/μL，RT-qPCR靈敏度是常規(guī)PCR的100倍。

圖3 PVSO RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 PVSA RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

熒光值由高到低依次為重組質(zhì)粒1.09×108，1.09×107，1.09×106，1.09×105，1.09×104，1.09×103拷貝/μL和水的熔解曲線。

2.4 田間樣品檢測結(jié)果

來源于11個省(市、自治區(qū))馬鈴薯田的90個樣品擴(kuò)增后，熔解曲線在85.82～87.95 ℃出現(xiàn)3組特異峰(圖7)，與DAS-ELISA檢測結(jié)果和測序結(jié)果相符。不同樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值相差0.86～2.13 ℃。其中Tm在85.82～86.10 ℃是PVSO株系，86.96～87.95 ℃是PVSA株系，在86.23～86.63 ℃出現(xiàn)特異峰的為同時感染PVSO和PVSA的樣品。馬鈴薯中PVSO含量在9.08×105～5.92×107拷貝/μL，馬鈴薯中PVSA含量在1.67×107～2.15×108拷貝/μL。

熒光值由高到低依次為重組質(zhì)粒1.26×108，1.26×107，1.26×106，1.26×105，1.26×104，1.26×103拷貝/μL和水的熔解曲線。

圖7 大田馬鈴薯樣品熔解曲線

2.5 馬鈴薯植株5個部位PVS含量測定

5個部位組織中PVS病毒含量(表1)均在107及以上數(shù)量級。PVSO在尤金中5個部位每微升RNA中病毒拷貝數(shù)從高到低依次是葉柄、葉、根、莖和塊莖，而冀張薯12號根比葉含量高，但二者差異不顯著。PVSA在尤金的葉柄、葉、根和薯塊中病毒拷貝數(shù)在2.71×107(莖)～4.00×107(葉柄)，但部位間差異均不顯著；PVSA在冀張薯12號根中含量最高，為7.45×107拷貝/μL，與葉柄差異不顯著，二者顯著高于其在葉片、塊莖和莖中的含量。

表1 尤金和冀張薯12號5個部位PVSO和PVSA含量

3 討論與結(jié)論

合格的種薯是保證馬鈴薯高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效生產(chǎn)的前提，因此，對馬鈴薯病毒進(jìn)行高效、靈敏、快捷檢測就顯得尤為重要。生物學(xué)方法周期長，不適用于大量樣品，且指示植物的癥狀易受環(huán)境影響，還需結(jié)合血清法進(jìn)行判斷。血清學(xué)DAS-ELISA法適合樣品量較大的田間樣品，不適用于病毒含量較低的休眠薯塊以及莖尖脫毒后生長的微量試管苗材料，此外，亦不能區(qū)分PVS株系。RT-qPCR技術(shù)彌補(bǔ)了這些不足，是一種高效、靈敏、快捷的檢測方法，并已用于多種病毒的檢測。

PVS序列變異較大，PVSO分離株HB24和PVSA分離株HB7的序列同源性為81.92%(經(jīng)NCBI Blast 比對)。本試驗(yàn)在兩序列保守區(qū)域CP基因處設(shè)計引物，經(jīng)比對上游引物(PVS-F)僅在兩序列7 763位堿基不同，在引物5′端第3位，未作處理。下游引物(PVS-R)僅在兩序列8 051位堿基不同，應(yīng)用了1個簡并堿基R(R=A/G)來提高檢測準(zhǔn)確性。經(jīng)比對分析，引物與GenBank中登錄的PVSA和PVSO株系有較好的匹配度。其中，PVSO-CS序列遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，3個PVSO-CS株系中，2個屬于PVSO第1亞組，1個屬于PVSO第7亞組[15]，并未獨(dú)立于PVSO之外，且PVSA-CL序列位于PVSA組中[16]。此外，本試驗(yàn)設(shè)計的PVS通用引物已避開重組分離株的重組位點(diǎn)6 088，2 633，5 858，7 204 nt，匹配度較好。同時，PVSA和PVSO株系目的片段堿基差異較大，如HB24和HB7的目的片段理論Tm值相差0.8 ℃，因此，通過分析熔解曲線，不僅檢測到PVS病毒，而且可區(qū)分2個株系，中國90個PVS分離株Tm值差異為0.86～2.13 ℃。此外，該體系檢測特異性強(qiáng)，對于馬鈴薯上常發(fā)生的PVX、PVS、PVA、PVM和PLRV陽性樣品無擴(kuò)增，保證了檢測的準(zhǔn)確性。

不同地域之間的PVS序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[13]，因此需要考慮不同地域的PVS分離株擴(kuò)增情況。目前，中國PVS序列報道僅有29條，采自于河北、廣東、廣西、浙江和云南，未涵蓋我國主要的馬鈴薯種薯產(chǎn)區(qū)。因此，應(yīng)用來源于11個省(市、自治區(qū))的90個經(jīng)DAS-ELISA檢測感染PVS的葉片樣品，用于驗(yàn)證該檢測體系的實(shí)用性，檢測結(jié)果與DAS-ELISA法及測序結(jié)果一致，進(jìn)一步說明所建體系具有準(zhǔn)確性。而且馬鈴薯葉片中PVSO含量在9.08×105～5.92×107拷貝/μL，PVSA含量在1.67×107～2.15×108拷貝/μL，均在檢出限以上，因此該檢測體系具有較強(qiáng)的實(shí)用性。目前，多使用DAS-ELISA法檢測大田樣品病毒，但易出現(xiàn)假陰性。宋靜靜等[33]用ELISA方法在109個樣品中只檢測出4個PVS陽性樣品，而用RT-PCR則能檢出29個。在本研究中，可能是由于在夏季傳播PVS的蚜蟲更適宜生長，因而夏季采集的樣品PVS含量較高，因此DAS-ELISA法未出現(xiàn)假陰性，與RT-qPCR法檢測結(jié)果一致。此外，本研究中葉片樣品PVS含量較高也可能是DAS-ELISA與RT-qPCR檢測結(jié)果一致的原因。由于使用了簡并引物，該體系檢測靈敏度雖然比Cheng等[30]報道的低10倍，但準(zhǔn)確性高。PVS變異較大且表現(xiàn)隱癥，出現(xiàn)漏檢將對馬鈴薯種薯生產(chǎn)產(chǎn)生重大危害。另外，能同時檢測出2種株系也為了解我國PVS株系發(fā)生特點(diǎn)及遺傳多樣性研究打下基礎(chǔ)。該體系能準(zhǔn)確檢測馬鈴薯5種組織中的PVS。PVX 和PVS 是馬鈴薯莖尖脫毒工作中最難脫除的病毒，因此，最好的辦法是應(yīng)用該體系直接檢測備選休眠塊莖，剔除感染PVS的塊莖，由于該方法靈敏度足以檢測休眠塊莖，因此，不必把塊莖進(jìn)行催芽種植。而且該體系可檢測100 mg組織，對于檢測莖尖脫毒后的生長的微小試管苗樣品尤為適用，總之，可加速脫毒試管苗的剝離和篩選過程。PVSO在馬鈴薯葉片、葉柄、莖、根中的含量高于PVSA，但是休眠塊莖中相差不大；2個馬鈴薯品種5個部位PVS病毒拷貝數(shù)均大于107數(shù)量級，是RT-qPCR檢出限的10 000倍，因此，葉片、葉柄、莖、根和休眠塊莖等5個部位組織均可用于檢測，可根據(jù)實(shí)際情況和需求，選擇相應(yīng)的部位進(jìn)行檢測。

本研究針對PVS CP基因設(shè)計了一對通用簡并引物，建立了快速、準(zhǔn)確、特異的RT-qPCR檢測體系，可依據(jù)樣品熔解曲線鑒定PVSO和PVSA株系，該方法在馬鈴薯品種葉片、葉柄、莖、根和休眠塊莖等5個部位中檢出的PVS病毒拷貝數(shù)均大于107數(shù)量級，是RT-qPCR檢出限的10 000倍，準(zhǔn)確率高，實(shí)用性強(qiáng)，可為生產(chǎn)脫毒種薯提供技術(shù)支持。