施用生物有機肥對番茄果實品質(zhì)及土壤生物學(xué)特性的影響

姜莉莉，王開運，武玉國，王開元，王紅艷

(1.山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，山東 泰安 271018；3.山東慧泰華生物技術(shù)有限公司,山東 泰安 271000)

在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，因長期大量施用化學(xué)肥料和連作種植，出現(xiàn)了土壤退化、連作障礙嚴(yán)重、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降、生態(tài)環(huán)境惡化等一系列問題，對食品及環(huán)境安全造成嚴(yán)重威脅。在此背景下，生物肥料因環(huán)境友好、資源節(jié)約、綠色安全等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注，在無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中的地位不斷提高[1]。有研究報道，生物肥具有速效、長效和改良土壤的作用。同時，生物肥中所含的功能微生物還可將作物難以吸收的固定態(tài)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為易吸收的形態(tài)，提高養(yǎng)分供應(yīng)速率[2]。近年來，我國生物肥料研究和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展迅速，產(chǎn)業(yè)鏈基本形成，系統(tǒng)評價生物肥料在耕地質(zhì)量提升及農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改善中的作用，對我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和綠色農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)意義重大。

豐田寶生物有機肥(含高效固氮菌生物有機肥)是國家“十二五”科技支撐計劃中土壤改良項目的發(fā)明成果，由高效固氮菌、解磷菌、解鉀菌和拮抗菌組成功能菌群，與活化腐殖酸、磷礦粉、鉀礦粉等有機載體混合造粒而成。該生物有機肥在番茄、黃瓜、草莓、葡萄等作物上一次性施用，可完全替代化學(xué)肥料，同時還可改善農(nóng)產(chǎn)品外觀和口感[3]。然而，該生物肥對作物果實品質(zhì)的改善效果和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的調(diào)控機理尚不清楚。本研究以連續(xù)4 a 8次施用該生物有機肥的設(shè)施番茄及種植土壤為研究對象，分析其與常規(guī)施肥處理的土壤養(yǎng)分和微生物群落差異，探求該肥料提升農(nóng)田地力的效果及機理；同時比較不同施肥方式對番茄綜合品質(zhì)的影響，為連作土壤的生態(tài)改良、生態(tài)農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的提升提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 供試肥料

豐田寶生物有機肥(含高效固氮菌生物有機肥)，含高效固氮菌、解磷菌、解鉀菌和拮抗菌組成功能菌群，與活化腐殖酸、磷礦粉、鉀礦粉等混合造粒而成，含活菌數(shù)≥0.2億/g，有機質(zhì)含量≥40%，氮、磷、鉀總含量≤4.0%，由山東友邦肥業(yè)科技有限公司生產(chǎn)。對照肥料由農(nóng)戶在當(dāng)?shù)剞r(nóng)資店購置。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗共設(shè)2個處理，處理1：連續(xù)施用豐田寶生物有機肥4 a，每年種植2茬番茄，按500 g/株的劑量穴施后移栽番茄幼苗并覆土，澆透水，番茄整個生長期不再追施任何其他肥料；處理2：常規(guī)施肥處理，每年施用腐熟雞糞60 m3/hm2和復(fù)合肥(15-15-15)1 500 kg/hm2，淺翻入土，起壟后移栽番茄幼苗并澆水，待番茄第1批果實采收后追施沖施肥(15-15-15)150 kg/hm2，之后每隔10～15 d沖施1次，至果實采收結(jié)束每一生長季節(jié)共沖施8次。每個小區(qū)面積20 m2、定植80株為1個重復(fù)，每個處理重復(fù)3次，隨機分布，處理間設(shè)有1.5 m寬的緩沖帶。

1.3 試驗操作

試驗區(qū)設(shè)在山東省泰安市岱岳區(qū)房村鎮(zhèn)西良甫村(N35°57′56.14″, E117°11′23.62″)的設(shè)施番茄田，為番茄種植基地核心區(qū)，農(nóng)戶已連續(xù)種植番茄10余年，管理經(jīng)驗豐富。試驗設(shè)施為黃淮流域常見的簡易土墻日光溫室，由于連年施用化學(xué)肥料，土壤鹽漬化程度較高。每年8月中下旬定植第1茬三葉期番茄幼苗，坐果6層后打頂，次年1月上旬套種第2茬，2月拔第1茬秧，7月拔第2茬秧。2014年8月15日種植第1茬番茄，2018年6月21日末茬拔秧。每茬幼苗移栽前施用2%的吡蟲啉顆粒劑預(yù)防煙粉虱危害，移栽后30 d內(nèi)噴施噻蟲嗪1次防治煙粉虱，番茄坐果期噴施50%烯酰嗎啉·錳鋅可濕性粉劑3次，間隔20～30 d，預(yù)防番茄晚疫病等病害，日常管理按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)進行。

1.4 樣品采集與測定

2018年4月16日，采集末茬第1批番茄成熟果實進行品質(zhì)測定。每個小區(qū)隨機挑選9個可商品化果實測量單果質(zhì)量和果實的橫、縱徑，并計算果型指數(shù)。果實勻漿后，減壓干燥測定果實含水量。以NaOH滴定法測定可滴定酸含量。以蒽酮比色法測定可溶性糖含量[4]，鉬藍(lán)比色法測定Vc含量[5]，紫外-可見分光光度計法測定番茄紅素含量[6]。2018年6月5日(末茬拔秧前期)，每個處理選取20個點，采集5～15 cm土層土壤樣品，充分混勻、過篩后分成2份，一份以干冰保存并送樣，用于土壤微生物的高通量測定；另一份完全風(fēng)干，采用常規(guī)分析法測定土壤有機質(zhì)、銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀含量[7]。

微生物群落多樣性分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

抽提基因組DNA，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以帶有Barcode的515F/907R引物進行PCR擴增，產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行凝膠回收。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測定量后，按照測序量要求進行相應(yīng)比例混合后構(gòu)建Miseq文庫并測序。

Miseq測序得到的PE reads經(jīng)過拼接、質(zhì)控和過濾后進行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于OTU進行多樣性指數(shù)分析，對測序深度的檢測；基于分類學(xué)信息，在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2016和SPSS 18.0等軟件進行，差異顯著性采用Duncan新復(fù)極差法進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機肥對番茄果實品質(zhì)的影響

由表1可知，連續(xù)4 a施用該生物有機肥的番茄果實單果質(zhì)量、果型指數(shù)、含水量與常規(guī)施肥處理差異不顯著；番茄果實糖酸比4.39，較常規(guī)施肥對照3.95提高了11.1%；Vc含量108.2 μg/g，較常規(guī)施肥處理100.9 μg/g提高了7.2%；番茄紅素含量49.9 μg/g，較常規(guī)施肥對照44.4 μg/g提高了12.4%。由此可見，連續(xù)施用該生物有機肥，可顯著提高番茄果實的糖酸比、Vc和番茄紅素含量。同時，連續(xù)施用生物有機肥種植的番茄果實果肉為沙性，質(zhì)地緊實，口感好，表觀光亮，商品質(zhì)量大幅度提高。

表1 連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機肥對番茄果實品質(zhì)的影響

2.2 連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機肥對土壤養(yǎng)分含量的影響

由表2可知，連續(xù)施用生物有機肥4 a 8次，番茄種植土壤的銨態(tài)氮含量與常規(guī)施肥處理間沒有顯著性差異，表明該肥料中的固氮菌可通過生物固氮完全滿足番茄生長所需的氮素供應(yīng)。同時，連續(xù)4 a施用該生物有機肥處理土壤的有效磷、速效鉀和有機質(zhì)含量較常規(guī)施肥處理分別顯著提高147.0%，38.8%，35.6%。表明該生物肥所含的解磷菌和解鉀菌能夠高效分解土壤中難溶態(tài)磷和鉀供植物吸收；而肥料中的腐殖酸、黃腐酸鉀等有機載體也可顯著提高土壤的有機質(zhì)含量。

表2 連續(xù)施用生物有機肥對土壤養(yǎng)分含量的影響

2.3 連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機肥對土壤細(xì)菌群落組成的影響

由圖1可以看出，在屬水平上，連續(xù)4 a施用該生物有機肥可降低番茄種植土壤溶桿菌(Lysobacter)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、硝化螺菌屬(Nitrospira)、芽單胞菌(Gemmatimonadaceae)、藍(lán)藻細(xì)菌(Cyanobacteria)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)、噬纖維細(xì)菌(Cytophagaceae)的相對豐度；提高鏈霉菌屬(Streptomyces)、特呂珀菌屬(Truepera)、鹽單胞菌(Halomonas)、尿素芽孢桿菌(Ureibacillus)、海源菌(Idiomarina)和芽孢桿菌(Bacillus)的相對豐度。由圖2可以看出，在種水平上，連續(xù)施用該生物有機肥可顯著提高土壤芽孢桿菌中阿氏芽孢桿菌(Bacillusasahii)的相對豐度。

CK.常規(guī)施肥處理；FTB.連續(xù)4 a施用生物有機肥。圖2同。

圖2 不同施肥方式土壤細(xì)菌種水平差異顯著性

2.4 連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機肥對土壤微生物多樣性指數(shù)的影響

由表3可以看出，連續(xù)施用生物有機肥4 a的番茄種植土壤微生物Coverage和Simpson指數(shù)均高于常規(guī)施肥對照，Chao和Shannon指數(shù)低于常規(guī)施肥對照，表明生物有機肥可在一定程度上提高土壤微生物的覆蓋度和優(yōu)勢度。

表3 連續(xù)施用生物有機肥對土壤微生物多樣性指數(shù)的影響

3 討論與結(jié)論

土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)與能量流動的重要場所，也是微生物參與化學(xué)反應(yīng)的載體[8]。不同的施肥措施對土壤肥力及微生態(tài)環(huán)境影響較大。許云翔等[9]報道，施用生物炭6 a后，稻田土壤有機碳、有效磷和速效鉀含量顯著增加，增幅分別為34.6%，12.4%，26.2%。大量研究表明，生物肥料能將土壤中難溶態(tài)的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為可溶性養(yǎng)分供植物吸收，既可培肥地力，又能改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)[10]。庫永麗等[11]報道，微生物肥料可顯著提高獼猴桃果園土壤細(xì)菌、放線菌與真菌的比值，提高土壤肥力；同時，獼猴桃果實的維生素C和可溶性糖含量提高，可滴定酸含量下降。陳龍等[12]報道，微生物肥料替代15%化肥對干旱區(qū)玉米生長的影響與當(dāng)?shù)刈罴咽┓仕綗o顯著差異，但可改善土壤微生物環(huán)境。王文慶等[13]報道，施用0681微生物肥料可以改善土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)，增強土壤的持水、緩沖、保肥能力，減輕山藥病害發(fā)生。Li等[14]報道，生物肥料替代40%的化學(xué)肥料可以顯著提高土壤有機碳和可溶性有機碳含量，增加土壤中芽孢桿菌、木霉菌和假單胞菌等益生菌的豐度，降低鐮刀菌和輪枝菌等病原菌的數(shù)量。筆者團隊前期報道，施用含高效固氮菌、解磷菌、解鉀菌和拮抗菌生物有機肥替代化學(xué)肥料，可使設(shè)施番茄產(chǎn)量提高18.81%～22.30%[15]，但其對土壤生物學(xué)特性的影響尚不清楚。磷和鉀是植物生長所需的重要元素，但土壤中95%以上的磷和90%～98%的鉀不能被植物直接吸收利用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)4 a穴施8次豐田寶生物有機肥完全替代化學(xué)肥料，可滿足番茄生長所需的氮素供應(yīng)，這可能與高效固氮菌的生物固氮作用有關(guān)；還可顯著提高土壤有效磷、速效鉀和有機質(zhì)含量，這可能與該肥料中添加的解磷菌、解鉀菌及磷礦粉、鉀礦粉有關(guān)。同時，該肥料也顯著提高了番茄果實的糖酸比、Vc和番茄紅素的含量，改善了番茄的綜合品質(zhì)。

由于土壤微生物種類繁多、數(shù)量巨大，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法難以全面反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的實際情況[17]。高通量測序技術(shù)為土壤微生物多樣性分析提供了極大的技術(shù)支持。任天寶等[18]采用高通量測序技術(shù)研究表明，以生物炭處理的植煙土壤放線菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、裝甲菌門(Armatimonadetes)的群落豐度明顯提高。本研究采用高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，常規(guī)施肥處理的番茄種植土壤中硝化螺菌的相對豐度較高，可能與化學(xué)氮肥的大量施用有關(guān)[19]，導(dǎo)致部分銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮；溶桿菌和芽單胞菌相對豐度較高，可能是由于其與硝態(tài)氮呈正相關(guān)[20]；噬纖維細(xì)菌的相對豐度較高，這可能與雞糞中纖維素含量較高有關(guān)[21]。連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機肥處理的番茄種植土壤鏈霉菌屬相對豐度較高，可能是由于其與土壤有效磷呈正相關(guān)[19]；特呂珀菌屬、尿素芽孢桿菌和芽孢桿菌的相對豐度較高，表明該生物肥可提高土壤益生菌的相對豐度[22-23]，其中對阿氏芽孢桿菌的提高效果最為顯著，這與Wang等[24]報道的以海藻肥替代化學(xué)肥料種植番茄可顯著提高土壤阿氏芽孢桿菌相對豐度的結(jié)果一致。Feng等[25]也報道，土壤阿氏芽孢桿菌對有機肥處理的反應(yīng)最直接，其需要2～4 a的時間演變成為土壤優(yōu)勢種群，土壤阿氏芽孢桿菌相對豐度的提高對作物產(chǎn)量和土壤肥力的提高具有重要意義。由此可見，連續(xù)4 a施用含高效固氮菌生物有機肥可提高土壤益生菌的相對豐度，改良土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)，有利于番茄健壯栽培。

微生物群落結(jié)構(gòu)可通過多種指數(shù)進行表征[26]。Chao指數(shù)是主要用于估計群落樣品中包含的物種總數(shù)。Coverage指數(shù)是一個較為常用的測序深度指數(shù)，其在計算中加入了只含有1條序列的OUT數(shù)目和抽樣中出現(xiàn)的總序列數(shù)目，能較為真實的反映樣品的測序深度。Shannon指數(shù)考慮到樣品中的分類總數(shù)和每個分類所占的比例，群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數(shù)越大。Simpson指數(shù)通過計算隨機取樣的2個個體屬于不同種的概率，來表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度[27-28]。提高微生物群落的多樣性有助于提高土壤生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力、穩(wěn)定性和可持續(xù)性[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)施用該生物有機肥4 a的番茄種植土壤，其微生物Coverage和Simpson指數(shù)均高于常規(guī)施肥對照，Chao和Shannon指數(shù)均低于常規(guī)施肥對照，表明該生物有機肥可在一定程度上提高土壤微生物的覆蓋度和優(yōu)勢度。