不同溫度對(duì)桑葉菜1-脫氧野尻霉素含量的影響

李 娜 范 偉 賈漫麗 王彬彬 陳秀靈 楊貴明 李季生

(河北省高校特產(chǎn)蠶桑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所，河北承德 067000)

蠶桑是我國(guó)的傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。近幾年來(lái)，隨著蠶桑資源多元化利用的開(kāi)展，桑樹(shù)的飼用、食用和生態(tài)價(jià)值凸顯，藥用價(jià)值更是備受關(guān)注[1-2]。研究表明，桑葉中含有的1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)可以抑制α-葡萄糖苷酶、葡萄糖淀粉酶的活性，具有抗病毒、減肥和增加胰島素敏感性等多種重要生理功能[3]。所以，開(kāi)發(fā)適宜于大眾食用的桑葉產(chǎn)品尤為重要。桑葉菜是近年來(lái)研究較多的食品之一，鮮嫩的桑葉菜不僅顏色嫩綠，口感也深得消費(fèi)者喜歡。用桑葉菜制作的涼拌菜、餃子餡等菜品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，還具有降血糖的獨(dú)特作用。如果在此基礎(chǔ)上，通過(guò)預(yù)處理改變桑葉菜的貯藏和加工溫度來(lái)間接的提高其降糖成分的含量，將對(duì)更加有效地利用桑葉極為關(guān)鍵。Yu X等[4]為了確定霜凍對(duì)桑葉化學(xué)變化影響的分子機(jī)制，研究了桑葉(Morus alba L.)中類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)活性、表達(dá)水平和黃酮苷的積累三者之間及其與溫度之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不僅平均溫度的高低與UFGT基因表達(dá)水平和UFGT活性呈顯著負(fù)相關(guān)，而且霜凍后的低溫可以誘導(dǎo)桑葉中UFGT基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致黃酮苷的積累。季節(jié)性溫度變化對(duì)不同生長(zhǎng)季節(jié)的DNJ含量有顯著影響[5]， 4月至5月間低溫下DNJ含量較低，而7月至8月夏季DNJ含量最高，9月后DNJ含量隨溫度逐漸下降。張魏琬麒等[6]研究發(fā)現(xiàn)，桑葉經(jīng)霜前后發(fā)生變化的主要是環(huán)境溫度，平均氣侯溫度與次生代謝產(chǎn)物含量間的相關(guān)性分析顯示，氣溫與黃酮類(lèi)4個(gè)成分總和含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與DNJ含量呈極顯著正相關(guān)。一些相關(guān)研究也表明，溫度是影響生物堿含量的重要因素，溫度升高可促進(jìn)生物堿的積累[7-8]。以上的研究主要是針對(duì)正在生長(zhǎng)中的桑樹(shù)進(jìn)行分析得出的結(jié)論，那么溫度對(duì)離體桑葉是否也具有類(lèi)似的作用？秦櫻瑞等[9]通過(guò)對(duì)熱風(fēng)干燥、微波干燥、冷凍干燥和真空干燥4種干燥方式的比較及綜合分析發(fā)現(xiàn)，溫度為75 ℃，時(shí)間為60 min的熱風(fēng)干燥后可得色澤較好的桑葉粉，其中含水量為(4.87±0.21)%，DNJ、總黃酮、多糖的含量分別為(227.47±5.79) mg/100 g、(49.51±1.18) mg/g和(11.29±0.01)%，普遍高于其他3種處理方法，同時(shí)熱風(fēng)干燥后桑葉品質(zhì)也較好，均呈現(xiàn)嫩綠色；通過(guò)測(cè)定桑葉粉對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用發(fā)現(xiàn)，干燥后桑葉粉并未失去降糖作用。這可能暗示了溫度對(duì)離體桑葉DNJ含量有一定的影響。鑒于此，本研究以3個(gè)適宜菜用的桑樹(shù)品種嫩梢為材料，通過(guò)改變不同貯藏和干燥溫度來(lái)研究其對(duì)離體桑葉DNJ含量的影響，采用高效液相色譜法測(cè)定DNJ的含量，為桑葉菜的采收、儲(chǔ)藏和干燥工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 桑葉樣品采集、處理

試驗(yàn)中用到的桑葉均采摘自承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所蠶?？萍紙@內(nèi)，樣品采摘時(shí)間為2018年8月21日至23日上午8時(shí)，采摘部位為一芽四葉的嫩梢，桑樹(shù)品種為桑葉菜候選品種選792、桂花桑和冀桑2號(hào)。每個(gè)品種隨機(jī)采摘嫩梢，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行隨機(jī)分組，每個(gè)處理隨機(jī)分配，各重復(fù)3次以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

1.1.2 主要試劑

1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥98%)、9-芴甲氧羰酰氯(9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC-Cl)；色譜純乙腈、甲醇購(gòu)自上海阿拉丁試劑；甘氨酸、醋酸、濃鹽酸等其他試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

配備SPD-20AV紫外檢測(cè)器的高效液相色譜系統(tǒng)LC-2030(日本島津)； 萬(wàn)分之一分析天平(OHAUS AR224CN，奧豪斯儀器有限公司)，超純水系統(tǒng)(Micro Pure UV/UF，Thermo)，超聲波清洗儀(KS-300EⅡ型，寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司)，臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(VELOCITY 18R，Dynamica)等。

1.3 方法

1.3.1 樣品分組

1)一天內(nèi)桑葉菜DNJ含量隨溫度變化情況。桑樹(shù)品種選擇冀桑2號(hào)，采摘時(shí)間2018年8月23日，天氣晴，當(dāng)天最高氣溫29 ℃，最低氣溫16 ℃。從早晨6點(diǎn)準(zhǔn)時(shí)取樣至當(dāng)天18時(shí)結(jié)束，每隔2 h采樣1次，每次3個(gè)重復(fù)。每次采摘后立即放入超低溫冰箱(-80 ℃)冷凍保存，以維持葉內(nèi)活性成分的相對(duì)穩(wěn)定，之后統(tǒng)一進(jìn)行真空冷凍干燥，60目粉碎。

2)桑葉菜在不同干燥溫度下DNJ含量的差異。桑樹(shù)品種選擇冀桑2號(hào)和桂花桑，采摘時(shí)間2018年8月21日上午8時(shí)，干燥方式分為真空冷凍干燥(鮮樣)、25 ℃烘干和40 ℃烘干，處理完畢后一起進(jìn)行60目粉碎。

3)桑葉菜不同溫度儲(chǔ)藏一天后DNJ含量變化。桑樹(shù)品種選擇桂花桑和冀桑2號(hào)，采摘時(shí)間2018年8月22日上午8時(shí)，桑葉菜隨機(jī)采摘后分別放置在-80 ℃，-20 ℃，4 ℃三個(gè)溫度條件下，取出后立即冷凍干燥，過(guò)60目篩。

4)桑葉菜變溫處理后DNJ含量差異。桑樹(shù)品種選擇選792，冀桑2號(hào)和桂花桑，采摘時(shí)間2018年8月23日上午8時(shí)，桑葉菜隨機(jī)采摘后先于4 ℃冰箱存放1 d，取出后立即在室溫條件下(25 ℃)放置0 d、1 d、3 d、5 d，然后分別收集至-80 ℃冰箱保存，冷凍干燥后粉碎，60目過(guò)篩，對(duì)照為鮮樣(真空冷凍干燥)。

1.3.2 DNJ提取

采用鹽酸提取法，首先準(zhǔn)確稱(chēng)量干至恒重的桑葉粉0.25 g，于50 mL離心管中加入25 mL 0.05mol/L鹽酸，渦旋震蕩混勻2 min后，超聲提取30 min，12 000 r/min高速離心30 min，取上清液于另一新50 mL離心管中，上述殘?jiān)^續(xù)加入0.05 mol/L鹽酸重復(fù)提取一次，將兩次的提取液合并，0.05 mol/L HCl定容至50 mL，分析待用。

1.3.3 衍生化過(guò)程

吸取200 μL待測(cè)樣品提取液至1.5 mL離心管后，向其中加入338 μL 0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液(pH8.5)，再加入250 μL濃度5 mmol/L的FMOC-Cl/乙腈衍生化試劑，在加入250 μL超純水之后，充分振蕩混勻，室溫下靜置反應(yīng)20 min。然后加入1 mol/L甘氨酸(Gly)200 μL來(lái)中和反應(yīng)中剩余的FMOC-Cl使反應(yīng)終止，最后加入1%(V/V)醋酸溶液132 μL，以生成穩(wěn)定的DNJ-FMOC?；靹蚝笥米⑸涫?.22 μm尼龍膜濾器過(guò)濾，收集濾液待上機(jī)分析。

1.3.4 色譜條件

高效液相分析采用RP-HPLC紫外檢測(cè)法，色譜柱為Kromasail-C18分析柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)及ODS3預(yù)柱(5 μm，4.6 mm×10 mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。室溫25 ℃，柱溫25 ℃，以乙腈-0.1%醋酸55∶45(V/V)比例的混合相作為流動(dòng)相，流速設(shè)置為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為20 μL/樣本，結(jié)束分析時(shí)間為60 min/樣本。對(duì)每個(gè)待測(cè)樣本采用3次上機(jī)重復(fù)測(cè)定。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定

依次配置1 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，30 μg/mL，40 μg/mL，50 μg/mL，60 μg/mL不同濃度的DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.3.3所使用的流動(dòng)相等色譜條件，分析標(biāo)準(zhǔn)樣品，最后以標(biāo)準(zhǔn)品溶液X不同濃度為自變量對(duì)因變量峰面積Y值做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，得出樣品提取液DNJ濃度計(jì)算公式。

1.3.6 DNJ含量計(jì)算

使用Lab solutions色譜處理工作站分析軟件，分析計(jì)算提取液中DNJ?的含量采用外標(biāo)法。對(duì)每個(gè)待測(cè)樣本的3次重復(fù)測(cè)定DNJ吸收面積，按照DNJ標(biāo)準(zhǔn)品得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的計(jì)算公式，計(jì)算桑葉中DNJ含量的結(jié)果，取每個(gè)樣本3次重復(fù)的平均值，分析標(biāo)準(zhǔn)方差并對(duì)不同處理之間進(jìn)行顯著性分析。

桑葉中DNJ含量計(jì)算公式為：含量(mg/g)=提取液DNJ濃度(μg/mL)×提取液體積(mL)/樣品質(zhì)量(g)/1000

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t 檢驗(yàn)，作圖軟件為Origin 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

從圖1(A、B、C)可以看出，DNJ在1.3.4所述的色譜條件下分離良好，和其他組分能夠更好分離，從而保證了測(cè)試的準(zhǔn)確性。對(duì)1.3.5中制備的DNJ標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行上機(jī)分析，得到與不同濃度DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)應(yīng)的色譜峰面積值，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液X不同濃度為自變量對(duì)因變量峰面積Y值進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為1～60 μg/mL范圍內(nèi)，分析結(jié)果顯示出良好的線(xiàn)性關(guān)系(y = 13524x + 7391.3，且相關(guān)系數(shù)R2= 0.9998)，符合線(xiàn)性回歸標(biāo)準(zhǔn)(圖1D)。

2.1.2 12 h內(nèi)桑葉菜DNJ含量隨氣溫的變化情況

在前人的研究中，桑葉隨季節(jié)的變化呈現(xiàn)出一定的規(guī)律，這對(duì)了解桑葉菜中DNJ的季節(jié)性變化規(guī)律有很大幫助，同時(shí)對(duì)生產(chǎn)也有很好的指導(dǎo)意義。但在桑葉菜的實(shí)際生產(chǎn)中，除了要關(guān)注季節(jié)性變化，也必須要研究桑葉菜在一天內(nèi)的適宜采摘時(shí)間，也就是要關(guān)注桑葉菜DNJ含量隨一天內(nèi)氣溫的變化規(guī)律。從圖2可以看出，隨著氣溫的不斷升高，DNJ含量呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)。在上午8時(shí)到下午2時(shí)這7 h內(nèi)，DNJ含量均達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明桑葉菜的采摘適合在這一時(shí)間段進(jìn)行。同時(shí)，由于是12 h內(nèi)的樣品，桑葉菜DNJ含量隨氣溫的變化也暗示了溫度與DNJ含量存在某種關(guān)聯(lián)。

2.1.3 不同溫度干燥對(duì)桑葉菜DNJ含量的影響

在正常生長(zhǎng)的桑葉菜中，DNJ含量隨氣溫的升高呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)。在桑葉菜采摘后能否利用DNJ隨溫度變化這一特點(diǎn)來(lái)提高其含量有待進(jìn)一步研究。圖3所示，將桂花桑和冀桑2號(hào)桑葉菜采摘后分別立即采用真空冷凍干燥(-60 ℃)、25 ℃常溫烘干和40 ℃低溫干燥3種方式來(lái)處理桑葉菜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著干燥溫度的上升，DNJ含量呈現(xiàn)出顯著或極顯著的上升趨勢(shì)。研究結(jié)果說(shuō)明溫度對(duì)離體的桑葉菜中DNJ含量同樣具有類(lèi)似的作用。

2.1.4 不同貯藏溫度對(duì)桑葉菜DNJ含量的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證溫度對(duì)桑葉菜DNJ含量的影響，分別采摘桂花桑和冀桑2號(hào)桑葉菜進(jìn)行不同溫度貯藏實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4所示，將桑葉菜分別放置到-80 ℃、-20 ℃和4 ℃三個(gè)溫度梯度的冰箱中，放置一天后立即真空冷凍干燥并進(jìn)行測(cè)試。隨著貯藏溫度的升高，兩個(gè)品種桑樹(shù)呈現(xiàn)出類(lèi)似的變化趨勢(shì)，DNJ含量均隨著溫度的升高顯著或極顯著上升。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了溫度與DNJ含量的關(guān)系。

2.1.5 變溫處理和存放時(shí)間對(duì)桑葉菜DNJ含量的影響

從2.1.4中可以發(fā)現(xiàn)，選擇4 ℃進(jìn)行貯藏可以顯著或極顯著的增加DNJ含量，這對(duì)于桑葉菜干燥過(guò)程中的存放溫度有一定的指導(dǎo)意義。在4 ℃條件下，桑葉菜既能保持鮮綠的品質(zhì)，還有助于提高DNJ的含量。在此條件下，將桑葉菜再次放置到25 ℃室溫中是否還能進(jìn)一步提高DNJ的產(chǎn)量也值得研究。因?yàn)樵谏Ｈ~菜的銷(xiāo)售過(guò)程中，將桑葉菜始終保持在冰箱中勢(shì)必會(huì)增加成本，而通過(guò)冷鏈運(yùn)輸后擺在貨架上進(jìn)行銷(xiāo)售也有一定的鮮活時(shí)限，那么在三至五天的銷(xiāo)售過(guò)程中DNJ含量是否會(huì)保持恒定就極為關(guān)鍵。為此，采摘選792、桂花桑和冀桑2號(hào)3個(gè)桑樹(shù)品種進(jìn)行變溫實(shí)驗(yàn)。桑葉菜采摘后放置在4 ℃冰箱中1 d后取出，模擬貨架擺放在25 ℃環(huán)境中1～5 d，然后進(jìn)行真空冷凍干燥和色譜分析。以-80 ℃樣品為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)，3個(gè)桑樹(shù)品種桑葉菜DNJ含量在貯藏取出后基本保持恒定，選792和冀桑2號(hào)均有顯著或極顯著的增加趨勢(shì)。說(shuō)明常溫存放桑葉菜不會(huì)降低有效成分DNJ的含量。

3 討 論

桑葉菜是近年來(lái)新興的葉菜類(lèi)食品，由于具有很好的降糖效用，已經(jīng)成為部分消費(fèi)者青睞的菜品之一。本研究以桑葉菜降糖成分DNJ為指標(biāo)，探討了桑葉菜的采收、貯藏和干燥因素對(duì)DNJ含量的影響，為合理的開(kāi)發(fā)利用桑葉菜食品提供了一定的理論支持。研究發(fā)現(xiàn)，溫度的提高能夠有效增加桑葉菜中DNJ的含量。無(wú)論是正常生長(zhǎng)中的葉片，還是采摘后離體的桑芽，亦或是不同的干燥溫度下的芽菜，都能很好地說(shuō)明這一結(jié)論。楊兵等[10]研究了不同生長(zhǎng)季節(jié)桑葉中1-脫氧野尻霉素、蘆丁及多糖含量的動(dòng)態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNJ含量在7、8月份含量最高，說(shuō)明了夏季的高溫有利于桑葉DNJ的合成。朱旭東等[11]研究了不同地域和季節(jié)蠶沙中DNJ含量的差異，從家蠶富集DNJ的角度間接的表明了溫度升高對(duì)DNJ含量增加的積極影響。

溫度等外界因子對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的積累有一定的影響，而這種影響對(duì)植物本身來(lái)說(shuō)可能是一種天然的應(yīng)激或保護(hù)[12]。初步掌握影響植物次生代謝產(chǎn)物積累的規(guī)律，對(duì)人們更加合理的開(kāi)發(fā)利用植物資源具有一定的指導(dǎo)意義。和草本植物相比，木本植物次生代謝過(guò)程更加復(fù)雜，代謝產(chǎn)物多樣，研究也相對(duì)困難[13]。植物次生代謝途徑的多樣性決定了其生物合成網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，許多植物次生代謝途徑仍然不清楚。但隨著近幾年基因組、功能基因組理論和技術(shù)的快速發(fā)展，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)[14]、代謝組學(xué)和基因組學(xué)[15]、代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)[16]，以及蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)[17]等相結(jié)合的方法，使一些植物的次生代謝途徑取得了重要進(jìn)展，部分次生代謝過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程相繼被闡明[18]。Dujun Wang等[19]人構(gòu)建了具有同DNJ含量的桑葉樣品的兩個(gè)cDNA文庫(kù)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)鑒定出38個(gè)獨(dú)特的候選基因可能參與DNJ生物堿生物合成，發(fā)現(xiàn)5種CYP450轉(zhuǎn)錄物和兩種甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄物與DNJ含量顯著相關(guān)，為進(jìn)一步研究桑樹(shù)DNJ生物堿的生物合成途徑提供了數(shù)據(jù)支撐。

在本研究中，DNJ含量變化究竟是由于基因的變化還是其他原因還很難判斷。這是因?yàn)?，桑葉在采摘后細(xì)胞并未凋亡，體內(nèi)的生命活動(dòng)不會(huì)終止。而由于溫度的升高，桑葉葉片內(nèi)部的物質(zhì)成分會(huì)發(fā)生一系列的轉(zhuǎn)化。如果這種轉(zhuǎn)化造成了桑葉重量的減少，那么相對(duì)而言DNJ的含量勢(shì)必會(huì)升高。雖然試驗(yàn)中將桑葉菜放置到-80 ℃和-20 ℃兩個(gè)條件下進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)DNJ含量依舊在變化，也很難說(shuō)明-20 ℃的溫度就能抑制桑葉的生命活動(dòng)。鑒于此，還應(yīng)該更進(jìn)一步的研究不同溫度下桑葉重量的損耗，才能排除這種因素的影響。

4 結(jié) 論

4.1 天氣溫度的升高有利于桑芽菜DNJ含量的升高，上午8時(shí)至下午2時(shí)期間DNJ含量達(dá)到較高水平。

4.2 結(jié)合不同溫度對(duì)桑葉DNJ含量的影響以及所產(chǎn)生的能耗等因素，桑葉菜4 ℃貯藏以及低溫干燥均可以提高DNJ含量。