聯(lián)合檢測被轉(zhuǎn)化生長因子b 激活的長鏈非編碼RNA和糖鏈抗原19-9 對胰腺癌的診斷和預后價值

侯巧梅，孟敏

胰腺癌是全球癌癥相關死亡的第四大原因。雖然目前對胰腺癌的生物學認識已經(jīng)取得了實質(zhì)性的進展，但目前還缺乏有效的篩查工具來檢測無癥狀的癌前病變和早期胰腺癌。此外，胰腺癌由于其深部位置和遲發(fā)癥狀經(jīng)常導致確診時已處于晚期，5 年總存活率僅約為5%。因此，迫切需要尋找新的潛在的生物標志物，為準確的預后預測和新療法的開發(fā)提供理論依據(jù)。目前，糖鏈抗原19-9（CA19-9）是診斷胰腺癌的經(jīng)典指標，對胰腺癌的診斷和預后具有良好的臨床價值。治療后CA19-9 水平升高表明預后不良，治療反應差。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是大于200 個核苷酸的非編碼RNA 的子集，其存在于細胞核或細胞質(zhì)中但不編碼蛋白質(zhì)。雖然大多數(shù)lncRNAs 的功能和機制尚不清楚，但先前的證據(jù)表明，lncRNA 在基因表達的轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。已有學者發(fā)現(xiàn)lncRNA 的異常表達與許多疾病相關。最近的一項研究使用lncRNA 微陣列譜發(fā)現(xiàn)胰腺癌中的lncRNA 表達在癌組織和癌旁組織間存在顯著差異。此外，一些研究表明，lncRNAs 通過調(diào)節(jié)細胞生長，遷移和侵襲參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。然而，關于lncRNA 在胰腺癌中作用的研究仍然十分有限。本研究旨在通過檢測胰腺癌病人治療前血清中被轉(zhuǎn)化生長因子b 激活的長鏈非編碼RNA（lncRNA-ATB）和CA19-9 的水平，探討lncRNA-ATB 對胰腺癌診斷和預后評估中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012 年4 月至2014 年7 月在安陽市人民醫(yī)院肝膽外科接受手術治療的胰腺癌病人作為觀察組。納入標準：（1）病理學確診為胰腺癌；（2）入組前未接受術前化療、放療或靶向治療。排除標準：（1）合并其他部位腫瘤；（2）合并血液系統(tǒng)疾病或嚴重肝腎功能疾病。共有103例病人納入觀察組。其中男性68例、女性35 例；年齡范圍為40～75 歲，年齡（58.46±7.93）歲；胰頭癌66 例，胰腺體尾部癌37 例；腫瘤長徑＜2 cm 者32 例，2～4 cm者58 例，＞4 cm 13 例。同時選取同時期住院的胰腺良性疾病病人150 例作為良性組，其中急性胰腺炎病人49例、慢性胰腺炎病人71例、胰腺良性占位病人30 例；男性105 例、女性45 例；年齡范圍為40～75 歲，年齡（57.88±8.04）歲。選取同時期健康體檢者150 例作為對照組，其中男性100 例、女性50 例；年齡范圍為45～65歲，年齡（57.13±6.35）歲。三組人群性別構成和年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求，所有病人都提供了書面知情同意書。

1.2 血清lncRNA-ATB 和CA19-9 水平檢測

抽取觀察組和良性組病人治療前、健康組體檢當日清晨空腹靜脈血4 mL，3 000 r∕min 離心取上清液。采用電化學發(fā)光法（雅培I2000 化學發(fā)光儀）檢測血清CA19-9，正常參考值范圍＜39 U∕mL。采用TRIzol試劑盒（Invitogen，Carlsbad，CA，USA）提取總RNA。使用轉(zhuǎn)錄子第一鏈cDNA 合成試劑盒（德國羅氏）將總RNA（1 μg）用序列特異性引物或錨定寡聚（dT）18 引物和隨機六聚體引物逆轉(zhuǎn)錄成互補cDNA。采用實時定量PCR（qRT-PCR），以β-肌動蛋白水平作為正常化對照檢測lncRNA-ATB 的相對表達量。引物序列見表1。反應條件如下：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火，延伸1 min，40 個循環(huán)。用2法計算lncRNA-ATB 的相對表達量。

表1 引物序列

1.3 治療方法和隨訪

良性組病人接受常規(guī)治療。觀察組接受手術治療為主，放化療為輔的綜合治療方式者27例，接受術后化療者36例，接受術后放療聯(lián)合化療者40 例。采用電話結(jié)合門診復診的方式進行隨訪，隨訪間隔為每3 個月隨訪1 次。隨訪截止日期為2019 年8 月1 日，失訪7 例?？傮w生存時間為第一次手術到胰腺癌相關死亡的時間（未發(fā)生死亡時間者為最后一次隨訪時間）。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

三組研究對象血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）和空腹血糖（GLU）均差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），而三酰甘油（TG）和總膽固醇（TC）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 三組研究對象血清CA19-9及l(fā)ncRNA-ATB比較

觀察組lncRNA-ATB和CA19-9水平均顯著高于良性組和健康組（均P＜0.05），良性組lncRNA-ATB和CA19-9水平顯著高于健康組（P＜0.05）。見表3。

表2 胰腺癌103例、胰腺良性疾病150例及健康體檢者150例一般資料比較

表3 胰腺癌103例、胰腺良性疾病150例及健康體檢者150例血清CA19-9及l(fā)ncRNA-ATB比較

2.3 血清

lncRNA-ATB

水平對胰腺癌的診斷效能

ROC曲線顯示，血清lncRNA-ATB、CA19-9以及兩者聯(lián)合的曲線下面積（AUC）分別為0.833（95%CI：0.793～0.868，P＜0.001）、0.765（95%CI：0.720～0.805，P＜0.001）、0.884（95%CI：0.849～0.914，P＜0.001）。其中，兩者聯(lián)合檢測與lncRNA-ATB 及CA19-9 的AUC差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。lncRNA-ATB與CA19-9 的AUC 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。當lncRNA-ATB 截斷值為2.85 時，lncRNA-ATB 胰腺癌的靈敏度為74.8%，特異性為79.0%。當CA19-9 截斷值為94.04 U∕mL時，CA19-9診斷胰腺癌的靈敏度為39.8%，特異性為99.3%；而兩者聯(lián)合檢測的敏感性為79.6%，特異性84.7%。見圖1。

圖1 血清lncRNA-ATB、CA19-9以及兩者聯(lián)合檢測診斷胰腺癌96例的ROC曲線（失訪7例）

2.4 血清lncRNA-ATB 與CA19-9的相關性分析

Pearson 相關分析顯示，lncRNA-ATB 與CA19-9呈顯著正相關（r＝0.307，P＜0.001）。見圖2。

2.5 血清lncRNA-ATB及CA19-9與胰腺癌病人預后的相關性分析

年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、血清lncRNA-ATB 相對表達量及血清CA19-9 納入COX 回歸模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高TNM 分期、較高血清lncRNA-ATB 相對表達量及較高血清CA19-9 是影響胰腺癌病人術后生存的獨立危險因素。見表4及圖3。

圖2 胰腺癌103例中病人血清lncRNA-ATB與CA19-9的相關性分析

表4 胰腺癌96例多因素生存分析

圖3 血清lncRNA-ATB相對表達量與胰腺癌96例總體生存率的相關性（失訪7例）

3 討論

胰腺癌是全球最常見和最致命的癌癥之一。因此，尋找新的分子靶點對于胰腺癌的診斷、預后和治療具有重要意義。隨著基因組測序技術的發(fā)展，人們普遍認為只有不到2%的人類基因編碼蛋白質(zhì)，剩下的98%編碼非編碼RNA（ncRNAs）。ncRNAs 包括lncRNAs 和環(huán)狀RNAs，最初被認為是轉(zhuǎn)錄的“噪音”或身體的“暗物質(zhì)”。近年來，越來越多的研究表明，lncRNAs在多種疾病，特別是惡性腫瘤中發(fā)揮著重要作用。

lncRNA-ATB 是位于chr14（q11.2）上的poly（A）-陰性的RNA。有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-ATB 在肝細胞癌中表達上調(diào)并且與預后不良相關。此外，也有學者發(fā)現(xiàn)lncRNA-ATB 是胃癌的獨立預后標志物，參與結(jié)直腸癌的進展和預后。同樣Shi等表明lncRNA-ATB 在乳腺癌病人的曲妥珠單抗耐藥SKBR-3細胞和曲妥珠單抗耐藥組織中顯著上調(diào)，并且可以促進曲妥珠單抗耐藥和乳腺癌中的侵襲-轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應。然而，關于lncRNA-ATB 在胰腺癌病人中診斷和預后中的作用知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，血清lncRNA-ATB 在健康對照者、良性疾病病人和胰腺癌病人中表達逐漸增高，表明血清lncRNA-ATB可能是胰腺癌早期診斷的潛在生物標志物。ROC曲線分析顯示，當lncRNA-ATB 的截斷值為2.85，CA19-9 的截斷值為94.04 U∕mL 時，血清lncRNAATB、CA19-9以及兩者聯(lián)合診斷胰腺癌的AUC分別為0.833、0.765、0.884。與CA19-9 相比，血清lncRNA-ATB 診斷胰腺癌的AUC 顯著增加，表明血清lncRNA-ATB對胰腺癌的診斷價值優(yōu)于CA19-9。進一步分析兩者聯(lián)合檢測對胰腺癌的診斷價值，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測可提高胰腺癌診斷的靈敏度和特異性，有助于提高診斷的準確性。

已有研究證實lncRNA-ATB 表達上調(diào)的結(jié)直腸病人預后更差。Jang 等發(fā)現(xiàn)，lncRNA-ATB 表達上調(diào)是影響肝細胞癌病人術后生存的獨立危險因素。此外，lncRNA-ATB 在胃癌組織中的表達高于正常組織，其表達水平與胃癌病人術后總生存率顯著相關。這些證據(jù)提示lncRNA-ATB可能在胰腺癌預后判斷中具有一定的價值。本研究發(fā)現(xiàn)，血清lncRNA-ATB表達上調(diào)的胰腺癌病人生存時間明顯縮短，與在其他腫瘤中的研究結(jié)果一致。

目前，lncRNA-ATB 參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的機制尚不完全清晰。Sun 等研究發(fā)現(xiàn)，相較于癌旁組織，胰腺癌組織的lncRNA-ATB 相對表達量下降。我們的研究則表明，胰腺癌病人lncRNA-ATB表達水平均顯著高于良性組和健康組。值得說明的是，與文獻報道相比，癌組織中l(wèi)ncRNA-ATB 表達水平仍要高于外周血表達水平，這可能是導致其釋放到循環(huán)的lncRNA-ATB 量還是要高于正常人的原因之一。此外，考慮到血液學生物標志物的變異性，重復測量可能提供更為精確的lncRNA-ATB相對表達量。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)血清lncRNA-ATB 在胰腺癌病人中表達顯著上調(diào)，是胰腺癌早期診斷和預后評估的潛在生物標志物。