微小核糖核酸-155、骨橋蛋白、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子水平與支氣管哮喘病兒氣管重塑的關(guān)系

王莎莎，趙敏，趙育紅，冉桃，宋珊

支氣管哮喘系屬慢性氣管炎性疾病，以氣管高反應(yīng)性、氣管炎性改變和可逆性氣管阻塞為主要特征，其病理變化過程有多種細(xì)胞浸潤(rùn)參與，包括嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞及T 淋巴細(xì)胞等，對(duì)氣管阻塞及氣管高反應(yīng)程度有重要影響，并決定了病人的病情預(yù)后。目前有多項(xiàng)研究表明微小核糖核酸-155（MicroRNA-155，miRNA-155）與肺部疾病相關(guān)，嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（Eotaxin）為一種可選擇性趨化因子，通過對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞的趨化、募集作用，影響氣管炎癥反應(yīng)。此外，骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）為非膠原性且?guī)ж?fù)電的磷酸化糖蛋白，在人體細(xì)胞、組織中廣泛存在，影響炎性因子分泌水平，可作為平滑肌細(xì)胞增殖或纖維化的參考指標(biāo)。以上三者均與哮喘發(fā)病過程密切相關(guān)，本研究通過檢測(cè)miRNA-155、OPN、Eotaxin水平在支氣管哮喘病兒中的表達(dá)，目的在于進(jìn)一步準(zhǔn)確評(píng)估哮喘病兒氣管重塑情況并對(duì)病情預(yù)后情況作出判斷，力求為臨床治療方法的改進(jìn)及治療效果的提高作出重要參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究前瞻性選擇成都市溫江區(qū)人民醫(yī)院于2016年5月至2018年12月期間收治的160 例急性發(fā)作支氣管哮喘病兒，根據(jù)高分辨率螺旋CT 診斷結(jié)果是否發(fā)生氣管重塑分為重塑組（54例）、非重塑組（106 例）；納入該院同期住院的其他呼吸系統(tǒng)疾病病兒60 例為對(duì)照組。其中重塑組男30 例，女24 例；年齡（7.19±1.64）歲，范圍為3～12歲；非重塑組：男59 例，女47 例；年齡（7.01±1.56）歲，范圍為3～11歲；對(duì)照組：男35例，女25例；年齡（6.97±1.52）歲，范圍為3～11 歲。各組性別（χ＝0.130，P＝0.937）、年齡（F＝0.325，P＝0.723）比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有病兒符合支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診為支氣管哮喘；（2）3歲≤病兒年齡＜12 歲；（3）近3 d 內(nèi)有輕度或中度發(fā)作史，且未使用抗膽堿能類、β2受體激動(dòng)劑、糖皮質(zhì)激素、茶堿類、白三烯拮抗劑和抗組胺類藥物；（4）已獲得病兒近親屬知情同意，病兒理解能力正常且能積極配合相關(guān)試驗(yàn)操作。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）排除嚴(yán)重心臟、肝、腎功能障礙以及實(shí)質(zhì)性病變的病兒；（2）排除急性發(fā)作期；（3）排除其他阻塞性呼吸系統(tǒng)疾病。（4）無法配合至試驗(yàn)結(jié)束者。

1.3 研究方法

1.3.1 氣管重塑指標(biāo)檢測(cè) 所有入選受試者均行高分辨率螺旋CT 輔助檢查，以評(píng)價(jià)氣管重塑情況，所有檢查均于同一CT平面，病兒仰臥并深吸氣屏住呼吸行多排螺旋CT薄層掃描，同時(shí)對(duì)氣管行估算法三維重建，以120 kV掃描電壓范圍始于肺尖終于肺底，層距10 mm，層厚1 mm，矩陣為512×512，窗位為-450 HU，窗寬為1 500 HU。選擇氣管隆突上下各1 cm、右側(cè)肺靜脈下緣2.5 cm和3 cm以及右側(cè)膈肌上緣五處其中一處氣管顯示清晰的部位。由兩位具有專業(yè)影像資質(zhì)的醫(yī)師單盲狀態(tài)下分別測(cè)量L（內(nèi)徑）、D（外徑），T（氣管壁厚度）＝（D-L）∕2、AI（氣管腔面積）、AO（氣管總橫斷面積）、WA%（氣管壁面積占AO 面積百分比）＝（AO-AD）∕AO 數(shù)值，測(cè)量后取均值，選擇eFilmcare圖像分析軟件，選取L、T、AI、WA 四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行比較。正常人支氣管壁平均為7 μm，哮喘病人支氣管壁平均為17 μm。

1.3.2 肺功能測(cè)定 所有受試者入組后由本院具有肺功能測(cè)定操作資質(zhì)的技師通過肺功能儀（SENSORMED-ICS2100）測(cè)定肺功能指標(biāo)包括：（1）用力呼氣量（FVC），F(xiàn)VC%超過80%即為正常，低于80%提示存在肺功能障礙；（2）一秒用力呼氣容積（FEV1），F(xiàn)EV1%低于80%提示存在肺功能受損；（3）一秒率（FEV1∕FVC），F(xiàn)EV1∕FVC%低于70%提示存在氣流阻塞；（4）呼氣峰流量（PEF），所得值越高表明呼吸肌力量以及氣管功能越好。

1.3.3 血清標(biāo)本采集與處理 所有受試者均于入組后常規(guī)監(jiān)測(cè)血壓，監(jiān)測(cè)血常規(guī)、嗜酸性粒細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白指標(biāo)：將抽血標(biāo)本于半小時(shí)內(nèi)通過1 500 r∕min速度離心2次，每次10 min，分離出上層血清后保存于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)備用。

1.3.4 miRNA-155 檢測(cè) 所有受試者入組后均采用Realtime PCR 儀檢測(cè)miRNA-155，檢測(cè)試劑盒由美國(guó)Qiagen 提供，根據(jù)說明書分別提取各組用RNA。分別利用紫外分光計(jì)測(cè)定230、260、280 nm波長(zhǎng)的吸光度，進(jìn)而確定總RNA 的濃度和純度；利用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)總RNA中18 s和28 s的比值，評(píng)估RNA的完整性和純度。反轉(zhuǎn)錄為各取總RNA 1 μg，5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’，miR-155 為RT-PCR 引物序列。85 ℃5 min、42 ℃42 min、16 ℃30 min為RT反應(yīng)程序。PCR實(shí)時(shí)定量反應(yīng)體系為：1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，21 μL 2.5 mmol脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP），2.5 μL 10×PCR 緩沖液，1.5 μL氯化鎂溶液，1 U Taq聚合酶，0.25×10 μmol終濃度SYBR Green I 的加水總體積達(dá)25 μL 的1 μL PCR 特異引物miR-574-5p：5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’，5’-GGGGGTGAGTGTGT-GTGTGT-3’。

1.3.5 OPN 檢測(cè) 所有受試者入組后均于晨起后空腹抽取靜脈血5 mL，常溫下放置20 min，以2 000 r∕min速度離心15 min，分離上層血清并采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)血清OPN 濃度，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒（上海圻明生物科技有限公司）說明書進(jìn)行操作。

1.3.6 誘導(dǎo)痰中Eotaxin 細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè) 所有受試者入組后均通過超聲霧化吸入高滲鹽水（4%）半小時(shí)，受試者誘導(dǎo)痰如未一次性成功可休息后病兒配合的情況下隔天再次進(jìn)行，直至誘導(dǎo)成功，采集痰標(biāo)本與0.1%二硫蘇糖醇混合并輕微震蕩于恒溫（37 ℃）水浴箱中15 min，待痰液徹底液化后濾除雜質(zhì)和黏液。采用ELISA檢測(cè)嗜酸細(xì)胞活化趨化因子細(xì)胞濃度，按照試劑盒（美國(guó)R&D Systems）說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀上根據(jù)450 nm主波長(zhǎng)和540 nm校對(duì)波長(zhǎng)對(duì)雙波長(zhǎng)進(jìn)行讀數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 氣管重塑指標(biāo)比較

重塑組、T、WA 均大于非重塑組，對(duì)照組最低，重塑組AI 低于非重塑組，對(duì)照組最高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 支氣管哮喘病兒（非重塑組、重塑組）與其他呼吸系統(tǒng)疾病病兒（對(duì)照組）氣管重塑指標(biāo)比較∕

2.2 肺功能比較

重塑組FEV1、PEF、FEV1∕FVC均低于非重塑組，對(duì)照組最高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 支氣管哮喘病兒（非重塑組、重塑組）與其他呼吸系統(tǒng)疾病病兒（對(duì)照組）肺功能臨床指標(biāo)比較∕

2.3 miRNA-155、OPN、Eotaxin比較

重塑組OPN、Eotaxin 高于非重塑組，對(duì)照組最低；重塑組miRNA-155 低于非重塑組，對(duì)照組最高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 支氣管哮喘病兒（非重塑組、重塑組）與其他呼吸系統(tǒng)疾病病兒（對(duì)照組）微小核糖核酸-155（miRNA-155）、骨橋蛋白（OPN）、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（Eotaxin）比較∕

2.4 相關(guān)性研究

Pearson 相關(guān)性分析表明，miRNA-155 與WA 呈負(fù)相關(guān)性，與FEV1∕FVC、FEV1 呈正相關(guān)（P＜0.05）；OPN、Eotaxin與WA呈正相關(guān)，與FEV1∕FVC、FEV1 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；與其他指標(biāo)無顯著相關(guān)性（P＞0.05），具體見表4。

3 討論

盡早發(fā)現(xiàn)病兒氣管重塑，盡早為病兒進(jìn)行干預(yù)性臨床治療現(xiàn)已成為研究哮喘的熱點(diǎn)。以用力呼氣量、一秒用力呼氣容積、一秒率以及呼氣峰流量作為肺通氣功能的重要指標(biāo)最為常用，可有效反應(yīng)氣流的阻塞程度。高分辨率螺旋CT 作為無創(chuàng)性輔助檢查，可對(duì)100～200 μm氣管結(jié)構(gòu)進(jìn)行識(shí)別，而直徑在1.5～2.0 mm左右的小氣管亦可清晰顯示，對(duì)哮喘病兒遠(yuǎn)端與近端的氣管重塑情況均有重要的意義。本研究中發(fā)現(xiàn)，氣管重塑組病兒氣管內(nèi)徑、氣管壁厚度和氣管壁面積明顯高于非重塑組，氣管腔面積明顯低于非重塑組，而氣管重塑組病兒的肺通氣功能普遍偏低，氣流受限明顯，對(duì)比對(duì)照組氣管腔面積最高，余氣管重塑指標(biāo)均最低，肺通氣功能狀況最好，由此可見，氣管重塑的出現(xiàn)明顯降低了病兒的通氣功能，加重病情。

表4 微小核糖核酸-155（miRNA-155）、骨橋蛋白（OPN）、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（Eotaxin）水平與支氣管哮喘病兒氣管重塑及病情指標(biāo)Pearson相關(guān)分析

miRNA 是在機(jī)體發(fā)育、生長(zhǎng)、分化過程中通過抑制蛋白轉(zhuǎn)譯或降解mRNA 等方式調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的非編碼微小核糖核酸，在健康人群或患病人群中，其血清均有大量特異表達(dá)的miRNAs，且在肺纖維化、肺癌和哮喘等病人體內(nèi)異常表達(dá)明顯。艾紅輝等研究發(fā)現(xiàn)miR-155在變應(yīng)性鼻炎中高表達(dá)，且與EOS（%）呈正相關(guān)。張熊等發(fā)現(xiàn)miRNA-155與支氣管網(wǎng)狀基底膜厚度及成纖維細(xì)胞數(shù)目具有相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著病兒氣管壁占?xì)夤芸倷M斷面積的增高，氣管重塑狀況的加重，其miRNA-155的表達(dá)明顯下降，病兒肺通氣功能狀況欠佳；與此同時(shí)，miRNA-155 診斷重塑組病兒的靈敏度和特異度為93.11%，進(jìn)一步表明miRNA-155 表達(dá)的越低，病兒氣管重塑狀況和病情越嚴(yán)重。相關(guān)研究表明，哮喘小鼠存在miRNA-155缺陷時(shí)則出現(xiàn)氣管重塑和Th2 細(xì)胞反應(yīng)增加，當(dāng)哮喘小鼠的miRNA-155被敲除時(shí)，其細(xì)胞可出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)以及氣管重塑。其作用機(jī)制可能是由于樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與miRNA-155調(diào)節(jié)功能相關(guān)，當(dāng)miRNA-155表達(dá)較少時(shí)可能出現(xiàn)哮喘炎癥反應(yīng)加重，形成氣管重塑，加重病情。

慢性炎性改變是氣管重塑的關(guān)鍵因素，OPN 作為骨基質(zhì)蛋白參與細(xì)胞粘附、凋亡和趨化等等多種病理性炎癥反應(yīng)，在機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過程中有著重要作用，可使哮喘病情進(jìn)一步加重，其作用機(jī)制主要是OPN 直接或間接與細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)相互作用，間接影響中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、趨化的過程。小鼠模型實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)小鼠處于變應(yīng)原致敏階段時(shí)，OPN 在激發(fā)階段以抗炎作用為主，其外源性O(shè)PN可引起嗜酸粒細(xì)胞增加。此外，OPN亦可密切參與氣管平滑肌的纖維化改變和氣管重塑，主要通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、金屬蛋白酶-9 和IL-13 等表達(dá)水平促使平滑肌的纖維化增強(qiáng)以及新生血管生成增加。而嗜酸細(xì)胞趨化因子是支氣管哮喘病人病情急性發(fā)作時(shí)的客觀標(biāo)志物，在氣管上皮內(nèi)可大量沉積并釋放陽離子蛋白、嗜酸性粒堿性蛋白等效應(yīng)分子，介導(dǎo)氣管的上皮炎性病變和重塑。其主要通過與EOS表面趨化因子受體選擇性結(jié)合，促使EOS炎性聚集。哮喘病兒急性發(fā)作時(shí)，活化的EOS脫顆粒后釋放大量活性生物蛋白，肥大細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后釋放大量組胺，支氣管角質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞受介導(dǎo)而損傷或脫落，黏膜通透性改變，感覺神經(jīng)纖維被暴露，進(jìn)而出現(xiàn)氣管高反應(yīng)，病情加重。Takeda等通過對(duì)支氣管哮喘相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)，隨著病人病情的加重，其氣管重塑狀況越明顯，肺通氣功能越差，OPN、Eotaxin 明顯升高。Naomi等通過對(duì)3歲左右支氣管哮喘病兒病情的影響因素發(fā)現(xiàn)，miRNA-155、OPN、Eotaxin 對(duì)于其病情變化發(fā)展有著重要作用，其表達(dá)水平的高低可直接影響疾病預(yù)后。結(jié)合本研究結(jié)果：重塑組OPN、Eotaxin高于非重塑組，對(duì)照組最低，OPN、Eotaxin 與WA 呈正相關(guān)，與FEV1∕FVC、FEV1呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，聯(lián)合檢測(cè)miRNA-155、OPN、Eotaxin水平可有效評(píng)估支氣管哮喘病兒氣管重塑及病情嚴(yán)重程度，為治療方案的調(diào)整和療效的提高提供重要依據(jù)。