ClO-識別的稀土熒光探針的合成及性能研究

蘇仙桃 楊浩 張曼

摘 要：以硝酸銪、熒光素、2-甲氧基苯甲醛、水合肼作為原料合成稀土熒光探針（FP）。使用核磁、紅外對稀土熒光探針（FP）進(jìn)行表征，確定探針中酚羥基和飽和甲基中氫的位置和稀土銪與探針1：3絡(luò)合存在。通過熒光光譜儀測試探針對次氯酸根離子的檢測能力，較SO42-、Cl-、CO32-、NO2-、CH3COO-、NO3-，探針對ClO-表現(xiàn)出了較強(qiáng)的選擇性，隨著次氯酸根濃度的逐漸增加，熒光強(qiáng)度呈線性增強(qiáng)（R2=0.9949）。對探針的實時檢測性能進(jìn)行研究表明：該探針熒光響應(yīng)時間為2min，在pH=6-8溶液中熒光強(qiáng)度達(dá)到最大且數(shù)值變化很小。表明該稀土熒光探針可用于ClO-高選擇性、高靈敏度的檢測識別。

關(guān)鍵詞：熒光素;稀土熒光探針;熒光探針;次氯酸根

中圖分類號：O614 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ?文章編號：1673-260X（2021）12-0010-05

1 引言

次氯酸鹽消毒劑是最早在世界上廣泛使用的消毒劑，次氯酸鹽消毒劑不僅廣泛使用于日常生活，而且經(jīng)常被用來進(jìn)行災(zāi)后的消毒殺菌。例如地震、洪水、化學(xué)事故等的地區(qū)，使用量巨大，使用單位多，使用面積廣闊。次氯酸鹽使用濃度超出一定范圍會成為潛在污染物，危害自然界甚至人類。因而，高靈敏度檢測環(huán)境和生命中的次氯酸鹽對相關(guān)疾病的早期預(yù)測具有重要意義。

戴志超[1]以5-羧基四甲基羅丹明、鄰苯二胺、DCC、4-二甲氨基吡啶、4′-溴甲基-2，2′， 6′，2″-聯(lián)三吡啶-6，6″-二甲胺四乙酸乙酯及TbCl3為原料得到探針TR-NO。探針TR-NO選擇I565/I540作為熒光強(qiáng)度比值與不同濃度的NO溶液反應(yīng)濃度從5.0μmol/L逐漸增加到400μmol/L時，溶液的I565/I540增強(qiáng)約27.8倍，表明該探針TR-NO對NO具有優(yōu)秀的比率時間分辨熒光響應(yīng)。

李漫[2]等人使用4-二苯氨基苯甲醛、水合肼合成識別ClO-的比率型熒光探針4-（肼基亞甲基）-N，N-二苯基苯胺（LM1），在乙醇-PBS的體系中，與ClO-反應(yīng)后，肉眼可見溶液由淺黃色變成無色，在紫外光下溶液由亮黃色逐漸變暗，因此可裸眼識別次氯酸根。與其他離子共存時，測試結(jié)果不受干擾。

吳擁軍[3]等人以熒光素、二氯乙烷、三氯氧磷、乙腈、2-甲氧基苯甲酰肼、三乙胺為原料得到2-甲氧基苯甲酰肼熒光素內(nèi)酰胺。該化合物本身無色無熒光，當(dāng)加入NaClO溶液后，明顯產(chǎn)生綠色熒光，其他分子不能使之產(chǎn)生熒光。因此證明熒光素酰肼是對NaClO具有高的選擇性、專一性靈敏性識別的探針。

姚書帆[4]等人以亞甲基藍(lán)（MB）為熒光母核，N，N-二甲基苯胺、二氯甲烷、連二亞硫酸鈉、Na2CO3 等為原料，合成了一種用于HOCl特異性檢測的近紅外熒光探針MB-1，該探針在檢測HOCl之后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，并且溶液顏色從無色變成藍(lán)色。該探針對HOCl具有較高的靈敏度，較好的抗干擾能力，為在生理水平上檢測HOCl提供了可能。

張偉杰[5]等人以香豆素為母體單元，4-（二乙胺基）水楊醛、乙酰乙酸乙酯、無水乙醇、二氯甲烷，巰基乙醇和甲基磺酸為原料合成了比率型次氯酸熒光探針。與次氯酸作用后熒光和紫外都產(chǎn)生明顯變化，無色溶液變?yōu)辄S綠色溶液，能夠?qū)崿F(xiàn)熒光檢測和裸眼識別。其他常見物質(zhì)對次氯酸的檢測均未產(chǎn)生干擾。因此探針擁有優(yōu)異的選擇性、較高的靈敏度以及較寬的pH值響應(yīng)范圍。

汪文杰[6]等人以熒光素為熒光團(tuán)，C=N為識別基團(tuán)，使用4-（二乙氨基）水楊醛和熒光素酰肼得到熒光探針（FD）。該熒光探針探針具有高的靈敏度和選擇性對于次氯酸的熒光分析，同時具有較低檢出限。實現(xiàn)了次氯酸在HeLa活細(xì)胞中的可視化熒光成像。

韓志湘[7]等人選擇7-二乙胺基香豆素-3-羧酸為母體，無水乙醚、2，4-二硝基苯肼、三乙胺為原料得到熒光探針分子。結(jié)果表明：與次氯酸反應(yīng)熒光顯著增強(qiáng)，同時溶液從無熒光變?yōu)樗{(lán)色強(qiáng)熒光。對次氯酸表現(xiàn)出特異性識別且響應(yīng)速度快，成功用于活細(xì)胞內(nèi)HOCl的可視化檢測。

邢又元[8]等人使用香豆素醛與萘酰亞胺雙熒光團(tuán)合成了一種比率型熒光探針。C=N雙鍵將香豆素醛與萘酰亞胺連接后增加了探針整體的共軛度而產(chǎn)生黃綠色熒光。加入次氯酸根后，探針會氧化水解為藍(lán)色熒光的香豆素醛，實現(xiàn)對ClO-的比率監(jiān)測。

賈斌[9]等人以水合肼、甲醇、二氯甲烷、三乙胺、丹磺酰氯、2-（4-二乙氨基-2-羥基苯甲酰基）苯甲酸為原料得到熒光探針（CuP1）。單獨的CuP1溶液熒光發(fā)射信號非常微弱，加入Cu2+后溶液熒光發(fā)射明顯增強(qiáng)，同時溶液從無色變?yōu)榧t色，實現(xiàn)了銅離子的裸眼識別。同等條件下，加入其他金屬離子后熒光光譜幾乎沒有變化。實驗結(jié)果證明了探針對Cu2+專一的選擇性。

丁娜[10]等人以2-羥基-1-萘甲醛為起始原料，通過兩步反應(yīng)，合成出了新型熒光探針L以2-（苯并噻唑-2-基）萘酚為熒光團(tuán)，7-硝基-2，1，3-苯并氧雜嗯二唑（NBD）為識別基團(tuán)。該探針可對H2S進(jìn)行專一性識別，探針L在pH為6.05～8.18的范圍內(nèi)對H2S表現(xiàn)出高靈敏性、高選擇性。

王莎[11]等人選擇芘甲醛、二氯亞砜、鄰氨基苯甲酸、N，N-二甲基甲酰胺、石油醚為原料設(shè)計合成了一種對Fe3+特異性響應(yīng)的熒光探針芘甲酰鄰氨基苯甲酸（PAA）。結(jié)果表明：PAA對Fe3+具有高選擇性、高抗干擾性的熒光響應(yīng)。隨著Fe3+濃度的升高，探針的熒光強(qiáng)度逐漸減弱﹐同時伴隨大量Fe3+螯合物沉淀的析出，從而使Fe3+從體系中富集出來，且在4倍濃度干擾離子存在的體系中，PAA對Fe3+的識別能力幾乎不受影響。

李愛玲[12]等人以高半胱氨酸、羅丹明、水合肼、二氯甲烷、乙酸乙酯、NaH2PO4、三氯化鋁，4-羥乙基哌嗪乙磺酸等為原料合成探針Hcy-RH6G2。通過對其熒光光譜性能，pH影響，選擇性，性能，機(jī)理等進(jìn)行研究。探針分子可以在HEPES緩沖溶液中快速地、有選擇性地識別Hg2+，具有較好的線性關(guān)系?？稍谳^寬的pH內(nèi)（pH=6.2～12.0）對Hg2+進(jìn)行高靈敏、高選擇性地檢測。

張璐[13]等人以乙酰乙酸乙酯、間苯二酚、二氯甲烷、正丁硫醇、三氟化硼、二乙基醚化物等為原料合成香豆素二硫縮醛熒光探針（L1）。通過對探針選擇性識別Hg2+的機(jī)理，抗干擾性等研究得：該探針對Hg2+熒光檢測具有高選擇性，能應(yīng)用于真實水樣中Hg2+的痕量檢測。

本實驗中選擇熒光素為母體，之后鄰甲氧基苯甲醛修飾。鑒于稀土熒光探針的時間分辨熒光分析技術(shù)可有效消除背景熒光干擾，呈現(xiàn)出高靈敏度的分析價值，合成擁有選擇性識別和熒光響應(yīng)功能的稀土熒光探針?；贑lO-氧化性，來實現(xiàn)熒光性能的開關(guān)轉(zhuǎn)變，作用于ClO-熒光分析檢測。

2 實驗藥品與儀器

2.1 實驗藥品

熒光素，分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司;水合肼，分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司;無水乙醇，分析純，天津恒興集團(tuán)有限公司;鄰甲氧基苯甲醛，化學(xué)純，西亞化學(xué)科技（山東）有限公司;乙腈，液相色譜淋洗液，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司;硝酸銪，分析純，西亞化學(xué)科技（山東）有限公司;次氯酸鈣，分析純，沈陽市華東試劑廠;氯化鉀，分析純，沈陽市華東試劑廠;無水碳酸鈉，分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠;亞硝酸鈉，分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司;乙酸鋅，分析純，天津恒興;硝酸鋁，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;硫酸鎂，分析純，沈陽市華東試劑廠。

2.2 實驗儀器

循環(huán)水式真空泵，SHD-（III），河南予華儀器有限公司;三用紫外分析儀，ZF-1，北京炳洋科技有限公司;數(shù)字超聲波清洗器，KQ-800DE，昆山市超聲儀器有限公司;真空干燥箱，DZF-6020AF，天津工興實驗室儀器有限公司;熒光分光光度計，F(xiàn)97，上海棱光技術(shù)有限公司;傅立葉變換紅外光譜儀，Nicolet iS5，美國Thermo fisher;數(shù)字熔點儀，WRS-1B，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司。

3 實驗部分

3.1 探針合成路線

3.1.1 中間體熒光素肼的制備

取一個100mL的蒸餾燒瓶，加入1.5g熒光素固體粉末，使用40mL的無水乙醇進(jìn)行溶解。再量取6mL的水合肼，磁力攪拌下緩慢加入，30分鐘內(nèi)滴加完畢。加熱至80℃，保持溫度持續(xù)加熱回流12h。反應(yīng)期間使用薄層色譜法（TLC）追蹤反應(yīng)進(jìn)程?；亓鹘Y(jié)束后，將液體冷卻至室溫，設(shè)置40℃左右真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑無水乙醇。然后向旋蒸結(jié)束后的溶液加入100mL的蒸餾水，有明顯絮狀物質(zhì)產(chǎn)生，靜置后底部有沉淀產(chǎn)生。將溶液抽濾，多次用水洗滌，洗滌到濾液無色，進(jìn)行真空干燥后得到米白色固體質(zhì)量為1.3041g，產(chǎn)物的產(chǎn)率為86.94%。測得中間體熔點為262～264℃。

3.1.2 稀土熒光探針的制備

稱量1.038g（3mmol）中間體2熒光素肼放入到100mL的蒸餾燒瓶中，加入20mL的無水乙醇進(jìn)行溶解。向其中滴加30mL無水乙醇溶解的鄰甲氧基苯甲醛（4.5mmol，0.612g）溶液，十分鐘左右滴加完畢繼續(xù)加入由10mL無水乙醇溶解的硝酸銪（1.5mmol， 0.669g）。加熱回流6h。反應(yīng)期間也要使用薄層色譜法（TLC）追蹤反應(yīng)進(jìn)程?；亓鞣磻?yīng)結(jié)束后，將溶液轉(zhuǎn)移到干凈的小燒杯中冷卻結(jié)晶，之后進(jìn)行抽濾，得到產(chǎn)物熒光探針質(zhì)量為0.8407g，熔點為303～307℃。

3.2 稀土熒光探針溶液的制備和檢測

稱取0.0616g熒光探針固體，使用乙腈配制成為濃度1mmol·L-1的貯存液，冷藏保存，待使用時稀釋到適應(yīng)濃度。其他陰離子SO42-、Cl-、CO32-、NO2-、CH3COO-、NO3-、ClO-、的標(biāo)準(zhǔn)溶液都配制為濃度2000μmol/L的溶液，依照實驗需要使用。實驗所用藥品均為分析純，實驗用水均為蒸餾水。

3.3 結(jié)果與討論

3.3.1 稀土熒光探針核磁共振氫譜數(shù)據(jù)

使用氘代DMSO為溶劑對探針進(jìn)行核磁氫譜掃描。1HNMR（DMSO，400MHz）：δ（ppm）3.73（s，3H），4.45（s，1H），6.50（m，4H），6.69（d，2H），6.89（t，1H），6.97（d，1H），7.11（d，1H），7.31（td，1H），7.46（dd，1H），7.61（m，2H），7.92（m，1H），9.18（s，1H），9.99（s，1H）。經(jīng)過核磁氫譜數(shù)據(jù)，3.75（s，3H）3個H是飽和甲基的氫，9.18（s，1H），9.99（s，1H）這兩個H是酚羥基的氫。從圖中可看出共有20個氫，我們可以判斷該化合物為我們的目標(biāo)產(chǎn)物。

3.3.2 稀土熒光探針紅外光譜數(shù)據(jù)

在4000-500cm-1范圍內(nèi)測定了熒光探針和及稀土熒光探針的紅外光譜，見圖4，熒光探針在3430cm-1和1470cm-1處的峰分別歸屬為酚羥基O-H單鍵和飽和甲基C-H單鍵吸收峰，當(dāng)加入稀土元素銪后，酚羥基O-H單鍵和飽和甲基C-H單鍵均受到影響。我們可以看到在3430cm-1的吸收峰發(fā)生紅移，1470cm-1處的吸收峰發(fā)生藍(lán)移。這是因為當(dāng)形成稀土熒光探針后，酰胺和飽和甲基都受到稀土離子銪影響吸收峰發(fā)生偏移?？梢耘卸ㄌ结樦杏邢⊥猎劁B并且以離子形式與探針1：3的配位存在。

3.5.3 探針對次氯酸根的選擇性識別

熒光探針的選擇性、專一性識別是鑒定熒光探針檢測次氯酸根性能的至關(guān)重要的一步。熒光探針濃度固定為5μmol/L，加入配制好的同濃度干擾陰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液SO42-、Cl-、CO32-、NO2-、CH3COO-、NO3-、ClO-。

圖5為熒光探針中加入不同干擾離子和次氯酸根的熒光光譜黑色條為熒光探針對各種干擾離子的熒光響應(yīng)情況。紅色條為加入次氯酸根后，熒光探針對各種干擾離子的熒光響應(yīng)情況。結(jié)合圖6熒光探針中加入干擾離子和次氯酸根的熒光強(qiáng)度變化可以看出，在其他干擾離子的存在下，熒光探針檢測次氯酸根幾乎沒有影響。證明該熒光探針對次氯酸根有良好的選擇性、專一性識別。

3.3.4 探針對次氯酸根的熒光滴定

熒光素有兩種異構(gòu)體分別為不產(chǎn)生熒光的螺環(huán)結(jié)構(gòu)和可以產(chǎn)生強(qiáng)熒光的開環(huán)結(jié)構(gòu)，大部分熒光素衍生物對生物小分子的識別機(jī)理都是建立在螺環(huán)結(jié)構(gòu)的開環(huán)變化基礎(chǔ)上。從下圖中可以看出，由于熒光素母體內(nèi)酯式結(jié)構(gòu)的存在，探針本身幾乎沒有熒光，與ClO-反應(yīng)后被氧化開環(huán)，生成氯代產(chǎn)物，進(jìn)一步脫氯得到最終產(chǎn)物，無論氯代產(chǎn)物，還是脫氯后的產(chǎn)物都能產(chǎn)生強(qiáng)熒光，實現(xiàn)了熒光從無到有的變化。

圖7為熒光探針檢測不同濃度次氯酸根熒光光譜。固定熒光探針溶液濃度為5μmol/L，分別配制濃度為3μmol/L、6μmol/L、9μmol/L、12μmol/L、15μmol/L、18μmol/L的次氯酸鈣溶液。將激發(fā)波長調(diào)為534nm，用熒光光度計分別測定以上6種不同濃度溶液的熒光值，從圖中可以看出，探針本身幾乎沒有熒光，隨著次氯酸根濃度的遞增，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

右上角為次氯酸鹽濃度與熒光強(qiáng)度線性關(guān)系圖。在激發(fā)波長為534nm處，不同濃度次氯酸根與熒光探針的熒光強(qiáng)度具有線性關(guān)系。線性方程為y=7.7x+758.5（線性度R2=0.99485），因此，此熒光探針可用以次氯酸根的定量檢測，如圖8所示。

3.5.5 不同pH值對熒光光譜的影響

為了探討環(huán)境和生物體的酸堿性對熒光探針實際應(yīng)用的影響，研究了探針的熒光值與pH值之間的關(guān)系。熒光探針濃度固定為5μmol/L，ClO-的濃度為20μmol/L。圖9所示為，當(dāng)熒光探針中不加入次氯酸根時，熒光探針對于pH的響應(yīng)非常弱，但在加入次氯酸根后，溶液的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大是在pH=6～8之間，且數(shù)值變化很小。因此，體系pH=6～8是該熒光探針最佳應(yīng)用范圍。

3.5.6 反應(yīng)時間對熒光強(qiáng)度的影響

為了研究該探針的檢測性能，熒光探針濃度固定為5μmol/L，ClO-的濃度為20μmol/L，對其不同時間下的熒光性能進(jìn)行檢測，從圖10可以看出，熒光強(qiáng)度急劇增大，在2min后，幾乎達(dá)到最大值。說明該探針具有對ClO-實時監(jiān)測的特點。

4 總結(jié)

本實驗以硝酸銪、熒光素、2-甲氧基苯甲醛、水合肼作為原料合成稀土熒光探針（FP）。鑒于稀土熒光探針的時間分辨熒光分析技術(shù)可有效消除背景熒光干擾，呈現(xiàn)出高靈敏度的分析價值，合成擁有選擇性識別和熒光響應(yīng)功能的稀土熒光探針（FP）。通過對稀土熒光探針自身以及添加不同濃度次氯酸根的稀土熒光探針進(jìn)行熒光測定，稀土熒光探針自身熒光強(qiáng)度很低，隨著次氯酸根濃度的逐漸增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（線性方程為y=7.7x+758.5）。使用干擾離子SO42-、Cl-、CO32-、NO2-、CH3COO-、NO3-檢測，在干擾離子存在下，稀土熒光探針的熒光強(qiáng)度變化很小，加入次氯酸根后熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，因此干擾離子對于稀土熒光探針檢測次氯酸根沒有影響，該探針對次氯酸根有良好的選擇性、專一性識別。對探針的實時檢測性能進(jìn)行研究，稀土熒光探針熒光時間響應(yīng)為2min說明該探針具有對ClO-實時監(jiān)測的特點。研究環(huán)境和生物體的酸堿性對熒光探針實際應(yīng)用的影響，測定加入次氯酸根前后的溶液對pH值的響應(yīng)，在pH值為6～8的溶液中熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，且數(shù)值變化很小。結(jié)合以上實驗結(jié)果說明該稀土熒光探針可用于ClO-高選擇性、高靈敏度的檢測識別。

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