仿生策略用于口腔頜面部骨再生與牙種植的研究進(jìn)展

蔣欣泉

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔修復(fù)科 上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 上?？谇会t(yī)學(xué)先進(jìn)技術(shù)與材料工程技術(shù)研究中心上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海200011

腫瘤術(shù)后、外傷、牙周病、先天畸形是導(dǎo)致口腔頜面部缺損的主要原因[1]，嚴(yán)重影響人的身心健康。如何有效保存和功能性修復(fù)口腔頜面部骨和牙等硬組織一直是臨床治療的重點(diǎn)和難題。近年來，再生醫(yī)學(xué)及先進(jìn)制造技術(shù)的發(fā)展使組織工程技術(shù)取得了長足的進(jìn)步，基于組織工程技術(shù)的頜面部硬組織的再生治療具有良好的臨床應(yīng)用前景。目前已有大量研究著眼于生物材料和干細(xì)胞投遞方式的功能化改性以提高骨組織再生的速度及質(zhì)量，其中，通過模擬生物的天然結(jié)構(gòu)及成分進(jìn)行仿生設(shè)計(jì)的策略通常簡潔而高效，逐漸成為研究熱點(diǎn)[2]。為有效行使承重、咀嚼、保護(hù)等重要功能，骨與牙進(jìn)化出了獨(dú)特的組織結(jié)構(gòu)，其基質(zhì)成分也與其他器官迥異，具有高度礦化的特征。研究者通過模擬硬組織的微納結(jié)構(gòu)、組成成分等對修復(fù)材料進(jìn)行改性，在治療頜骨缺損、種植區(qū)骨量不足、牙槽骨吸收等領(lǐng)域取得了較大進(jìn)展[3]。本文圍繞仿生策略用于口腔頜面部骨再生與牙種植的基礎(chǔ)與臨床研究，分別從仿硬組織微納結(jié)構(gòu)改性、仿硬組織離子成分改性和仿生細(xì)胞膜片等三個(gè)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為硬組織缺損和缺失的治療提供新思路。

1 仿硬組織微納結(jié)構(gòu)改性用于牙種植的研究進(jìn)展

仿生微納結(jié)構(gòu)改性指模擬天然組織的微米級或納米級結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供類似天然組織的微環(huán)境，具有一定的尺寸和表面效應(yīng)，促進(jìn)組織再生修復(fù)?？谇挥步M織，以骨組織為例，具有獨(dú)特的微納結(jié)構(gòu)，微米尺度上骨組織由致密的皮質(zhì)骨和疏松多孔的松質(zhì)骨組成，納米尺度上則是由膠原纖維多級礦化形成。利用天然骨組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)指導(dǎo)種植體表面從宏觀到微觀多尺度仿生設(shè)計(jì)，從而模擬體內(nèi)骨組織發(fā)育物理信號誘導(dǎo)干細(xì)胞或前成骨細(xì)胞的成骨分化，有望提高種植體周圍骨再生及種植體骨結(jié)合效果。常見骨組織微米結(jié)構(gòu)特征包括粗糙表面、取向排列、溝槽結(jié)構(gòu)等[4]，主要是源于骨組織非均一礦化的細(xì)胞外基質(zhì)、膠原纖維的取向排列以及破骨細(xì)胞在骨組織表面形成的吸收坑。納米尺度上，骨組織細(xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維表面散落著片狀或者棒狀的羥磷灰石納米晶體，片狀納米晶體寬15～30 nm，長30～50 nm，釉質(zhì)中的棒狀納米晶體厚25～100 nm，長100 nm 到數(shù)微米之間[5]。模擬天然羥磷灰石納米晶體，合成尺寸和形狀可控的納米晶體，被認(rèn)為是生物復(fù)合材料生物礦化和發(fā)揮成骨誘導(dǎo)功能的重要先決條件。盡管目前微納結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化機(jī)制尚不明晰，但通過模擬天然骨組織微結(jié)構(gòu)仍實(shí)現(xiàn)了較好的骨再生修復(fù)效果。

仿骨組織粗糙表面設(shè)計(jì)簡單、操作方便，目前臨床上最常采用的是噴砂、酸蝕技術(shù)。通過對種植體表面進(jìn)行處理，形成噴砂凹陷和酸蝕坑等微米結(jié)構(gòu)，來模擬骨組織表面凹凸不平的粗糙結(jié)構(gòu)，可有效改善口腔種植體骨結(jié)合效果。如Khang等[6]進(jìn)行的早期多中心臨床研究，對97 例患者植入了432 枚純鈦種植體（247 枚雙酸蝕處理，185枚機(jī)加工處理），在3 年時(shí)間內(nèi)36 枚種植體（12 枚雙酸蝕處理，24 枚機(jī)加工處理）失敗，雙酸蝕處理組的種植體-骨整合成功率達(dá)95%，顯著高于機(jī)加工處理的87%。

多級微納形貌構(gòu)建通過綜合使用堿熱處理、等離子噴涂等技術(shù)，可在微米孔洞結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步修飾出納米棒、納米花等結(jié)構(gòu)，從而形成納米—微米多級復(fù)合結(jié)構(gòu)。相較于仿骨組織粗糙表面設(shè)計(jì)形成的單一微米級結(jié)構(gòu)，多級微納結(jié)構(gòu)更接近于天然骨表面，顯示出更加優(yōu)異的成骨誘導(dǎo)性能，如Zhang 等[7]通過等離子噴涂技術(shù)，在鈦種植體表面制備了具有多級復(fù)合結(jié)構(gòu)的摻鍶鋅黃長石涂層，相較于微米級的羥磷灰石涂層對照組，微納復(fù)合結(jié)構(gòu)顯著增強(qiáng)了種植體表面的細(xì)胞黏附及體內(nèi)的骨結(jié)合效果。骨質(zhì)疏松等疾病是導(dǎo)致種植體骨結(jié)合不良的重要因素，而對種植體進(jìn)行表面改性，特別是構(gòu)建多級微納形貌可有效提升骨結(jié)合效果，如Liu 等[8]在骨質(zhì)疏松綿羊上進(jìn)行的研究證明，經(jīng)過酸蝕、磁控濺射綜合處理構(gòu)建的微納復(fù)合形貌提升干細(xì)胞附著、礦化的能力要顯著強(qiáng)于單一微米或納米形貌，而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了微納復(fù)合形貌組具有最強(qiáng)的骨結(jié)合強(qiáng)度，這提示，對于患有骨質(zhì)疏松等疾病的患者，采用多級形貌構(gòu)建來進(jìn)行種植體功能化改性可望獲得更好的治療效果。

2 仿硬組織離子成分改性用于口腔硬組織再生的研究進(jìn)展

微納尺度上模擬組織天然結(jié)構(gòu)改性支架的仿生策略可有效促進(jìn)硬組織再生，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析組織的構(gòu)成元素，模擬硬組織基質(zhì)成分對支架進(jìn)行改性，在局部構(gòu)建有利于細(xì)胞增殖分化的微環(huán)境的仿生策略亦是組織工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)。骨與牙作為高度礦化的組織，含有包括鈣（Ca）、鎂（Mg）、鍶（Sr）、鋅（Zn）、氟（F）在內(nèi)的多種生物活性離子[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，這些生物活性離子不僅是維持硬組織結(jié)構(gòu)必不可少的成分，還參與骨再生中多個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控，包括細(xì)胞成骨向分化、血管新生以及免疫調(diào)節(jié)。生物活性離子的這些生物學(xué)效應(yīng)展現(xiàn)出良好的骨再生應(yīng)用潛能，且價(jià)格低廉，為支架材料改性提供了更多的手段[11]。

誘導(dǎo)種子細(xì)胞與宿主細(xì)胞成骨、成牙向分化是口腔硬組織再生的關(guān)鍵。Sr、Mg、Zn、鈷（Co）、銅（Cu）、硅（Si）等離子皆被報(bào)道具有促進(jìn)骨再生的效應(yīng)[12-15]，此外Sr、Mg 還可具有成牙誘導(dǎo)功能[16-17]。如Mg 在體外可濃度依賴性地促干細(xì)胞成骨分化[18]，而Zhang 等[19]進(jìn)一步在體內(nèi)探究了Mg誘導(dǎo)成骨的機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，鎂合金降解產(chǎn)生的Mg 可促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)釋放神經(jīng)降鈣素基因相關(guān)多肽（calcitonin gene-related polypeptide，CGRP），CGRP 與骨膜干細(xì)胞結(jié)合后可誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨向分化。Lin 等[20]則從發(fā)育角度給出了Mg 促進(jìn)成骨的可能機(jī)制，該研究發(fā)現(xiàn)鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（magnesium transporter 1，MagT1）在小鼠胚胎軟骨內(nèi)成骨過程中高表達(dá)，從而以MagT1為橋梁將Mg與骨發(fā)育聯(lián)系在一起，并以MagT1的表達(dá)為指導(dǎo)優(yōu)選了Mg模擬骨發(fā)育微環(huán)境的最適濃度，構(gòu)建了含Mg干細(xì)胞3D 培養(yǎng)系統(tǒng)，在體內(nèi)取得了顯著的血管化骨再生效果。以生物活性離子的成骨誘導(dǎo)能力為基礎(chǔ)，復(fù)合功能化基團(tuán)修飾材料，有望賦予骨再生支架新功能。如Wang 等[21]通過在成骨性能優(yōu)良的生物活性玻璃（bioactive glass，BG）表面固定含二硫化鉬（MoS2）的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lac‐tic-co-glycolic acid），PLGA]功能性薄膜，制備出抗腫瘤/骨修復(fù)一體化修復(fù)材料。PLGA 膜內(nèi)釋放的MoS2具有良好的光熱抗腫瘤效應(yīng)，而BG 釋放出的Si、Ca 等活性離子可發(fā)揮成骨誘導(dǎo)效應(yīng)。在腫瘤切除后植入該支架，可在進(jìn)行骨修復(fù)的同時(shí)通過外界激光強(qiáng)度來控制局部溫度，灼燒剩余或復(fù)發(fā)的癌細(xì)胞，達(dá)到抗腫瘤與骨修復(fù)的協(xié)同一體化治療。

成血管過程與成骨過程相耦合，如何誘導(dǎo)支架快速血管化是決定再生效果的重要因素。Mg、Cu、Sr、Co 等離子具有一定的誘導(dǎo)血管生成能力[22-23]，如Sr可刺激干細(xì)胞分泌成血管誘導(dǎo)因子血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等募集內(nèi)皮細(xì)胞來促進(jìn)血管化[24]，Mg 可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分泌一氧化氮，促進(jìn)干細(xì)胞分泌VEGF加速血管化進(jìn)程[11]。值得注意的是，上述離子還具有骨誘導(dǎo)效應(yīng)，在支架中添加這些離子有利于協(xié)同成骨與成血管效應(yīng)，達(dá)到血管化骨再生的目的。如Tang等[25]利用Mg在體內(nèi)降解產(chǎn)生氫氣這一特性，將Mg 粉作為致孔劑，整合入水凝膠中構(gòu)建了體內(nèi)原位致孔體系。產(chǎn)氣形成的孔隙有利血管與組織的長入，同時(shí)局部降解產(chǎn)生的Mg 構(gòu)建了成骨及成血管誘導(dǎo)微環(huán)境，綜合提高再生效果。

支架植入體內(nèi)后，由于手術(shù)創(chuàng)傷、支架生物相容性、局部感染等因素將誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)，進(jìn)而影響局部的再生效果，如牙周炎將顯著影響牙種植治療的成功率，因此改性支架材料，使其能調(diào)節(jié)宿主免疫細(xì)胞功能，對維持穩(wěn)定的成骨微環(huán)境具有重要意義。Si、Mg、Zn、Sr 等離子皆被證明具有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，如Mg 可通過抑制Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）通路來降低促炎因子的釋放，Sr 可拮抗轉(zhuǎn)錄因子核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的促炎效應(yīng)，Zn 可通過調(diào)節(jié)TLR-4 通路促進(jìn)抗炎因子白細(xì)胞介素（inter‐leukin，IL）-10 的分泌，減少炎癥因子IL-1β、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 的產(chǎn)生。將生物活性離子作為涂層修飾種植體表面[26]，或接枝到膠原纖維上[27]，在取得骨誘導(dǎo)效應(yīng)的同時(shí)，還能調(diào)控免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞的極化，平衡促炎-抑炎反應(yīng)，取得更為明顯的骨再生效果。但離子的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)多存在劑量依賴性，如何優(yōu)化離子負(fù)載和釋放的濃度以使效應(yīng)最大化是應(yīng)用中的難題[28]。

使用離子成分改性的策略來提升種植體骨結(jié)合的臨床轉(zhuǎn)化研究亦取得新進(jìn)展。學(xué)者們[29-30]開展了種植體早期負(fù)重性能的多中心前瞻性研究，研究共納入了45 例年齡在20～75 歲的患者，種植一期手術(shù)后6～8 周即完成上部修復(fù)，并早期負(fù)重；1年的隨訪發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過氟離子聯(lián)合微納結(jié)構(gòu)改性后，種植體成功率達(dá)到100%，且早期邊緣骨水平不降反增，平均增長（0.08±0.41）mm；負(fù)重3年后，種植體成功率仍為100%，邊緣骨水平平均增長（0.23±0.48）mm，這對于提高種植體的成功率和延長咀嚼功能負(fù)載作用時(shí)間意義重大。

3 仿生細(xì)胞膜片用于口腔硬組織再生的研究進(jìn)展

除了對組織結(jié)構(gòu)/成分進(jìn)行仿生改性支架，還可對細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境進(jìn)行模擬。細(xì)胞外基質(zhì)是天然的細(xì)胞三維培養(yǎng)模型，構(gòu)建出仿細(xì)胞外基質(zhì)成分的支架對干細(xì)胞進(jìn)行投遞，有利于維持細(xì)胞特性，提高細(xì)胞投遞效率。細(xì)胞膜片技術(shù)是通過物理的方法將擴(kuò)增融合的細(xì)胞從培養(yǎng)皿底壁分離，獲得膜片狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一種技術(shù)[31-33]。運(yùn)用該技術(shù)收集到的細(xì)胞保留了體外培養(yǎng)過程中分泌的胞外基質(zhì)、細(xì)胞-基質(zhì)連接以及細(xì)胞間連接等結(jié)構(gòu)[32,34-35]，無須縫合就能較緊密地附著于其他細(xì)胞膜片、器官組織、生物材料表面，且靶細(xì)胞被外基質(zhì)固定很少流失，因此有利于細(xì)胞投遞。目前細(xì)胞膜片這一仿生結(jié)構(gòu)已廣泛應(yīng)用于包括關(guān)節(jié)軟骨、角膜、食管、心臟、牙周組織等各種組織器官修復(fù)研究中。

在口腔硬組織再生方面，Yang 等[36]將人牙囊細(xì)胞膜片與經(jīng)過處理的牙本質(zhì)支架復(fù)合，構(gòu)建牙根樣組織，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜片在牙本質(zhì)引導(dǎo)下形成牙髓和牙周樣結(jié)構(gòu)。Tsumanuma 等[37]將β-磷酸三鈣/膠原材料分別與牙周膜細(xì)胞膜片、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片和牙骨膜細(xì)胞復(fù)合后用于牙周再生修復(fù)。Vaquette 等[38]將牙周膜細(xì)胞膜片與支架復(fù)合，發(fā)現(xiàn)其新生骨與周圍骨組織整合良好。Zhou 等[39]報(bào)道將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片包裹塊狀磷酸三鈣/聚己酸內(nèi)酯復(fù)合材料，植入裸鼠背部皮下后，形成了具有一定抗壓強(qiáng)度的新生骨。更進(jìn)一步地，Shan 等[40]利用經(jīng)過成骨誘導(dǎo)的狗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片復(fù)合聚乳酸-羥基乙酸支架，修復(fù)犬下頜骨局部缺損，取得了理想的效果。細(xì)胞膜片技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化方面也有新的突破。近期，Xuan 等[41]進(jìn)行了干細(xì)胞用于牙髓再生的臨床研究，研究共納入了40 例牙外傷患者，其中30 例患者被隨機(jī)分配至試驗(yàn)組，將接受干細(xì)胞移植，而對照組患者將接受傳統(tǒng)的根尖誘導(dǎo)成形術(shù)；試驗(yàn)組患者的脫落乳牙牙髓干細(xì)胞被提取后，在體外培養(yǎng)形成細(xì)胞聚合體，并植入了外傷牙髓腔中；隨訪1 年后發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組患牙根管內(nèi)完成功能性牙髓再生，牙根增長和根尖孔閉合情況皆優(yōu)于對照組。

為了更好地在體外構(gòu)建組織、器官，Ito等[42-44]利用磁操作可“遠(yuǎn)程控制”的主要優(yōu)點(diǎn)，用磁性納米顆粒對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，可以通過施加外部磁場來操縱細(xì)胞和控制細(xì)胞功能，使細(xì)胞可受磁場作用沉積，形成細(xì)胞膜片，目前已應(yīng)用于皮膚、肝臟和肌肉組織工程中組織樣結(jié)構(gòu)的制備。為了提高細(xì)胞膜片在組織再生應(yīng)用中的效率，Zhang等[45]制備了一種新型氧化石墨烯包裹的四氧化三鐵磁性納米顆粒，利用這一顆粒氧化石墨烯外殼結(jié)合蛋白質(zhì)的特性，提出了一種全新的生長因子復(fù)合細(xì)胞膜片概念，通過制備的新型磁性納米顆粒，首次實(shí)現(xiàn)了體外生長因子與干細(xì)胞復(fù)合微組織的磁場精確控制構(gòu)建，該策略明顯提高了傳統(tǒng)細(xì)胞膜片技術(shù)在體內(nèi)的組織再生效果，為復(fù)雜組織例如骨-軟骨復(fù)合體缺損的再生提供了新的思路。

雖然利用仿生策略提升骨再生與牙種植治療效果的研究成果不斷，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)：目前對口腔硬組織，特別是骨組織的微納結(jié)構(gòu)已有較為全面的認(rèn)識，但結(jié)構(gòu)的仿生設(shè)計(jì)仍停留于單純的形貌模仿，對其分子調(diào)控機(jī)制尚缺乏深入了解；使用離子成分改性支架時(shí)，如何優(yōu)選離子濃度以達(dá)到最佳的再生效果，此外離子成分對硬組織發(fā)育和代謝的調(diào)控機(jī)制仍然不明；仿生組織構(gòu)建時(shí)，如何解決構(gòu)建的大塊組織的血供以防止細(xì)胞壞死凋亡等。隨著組織工程與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，上述挑戰(zhàn)在不遠(yuǎn)的將來有望解決，借助3D 打印等先進(jìn)制造技術(shù)，更多的仿生功能材料將進(jìn)入轉(zhuǎn)化用于臨床，為口腔硬組織缺損的再生治療提供新的選擇和可能。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。