山銀花黃酮類提取物對人肝L-02細胞甘油三酯蓄積及SREBP-1c表達的影響

李 熠,匡穩(wěn)定,周容容,桂慶軍,匡雙玉*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院)

山銀花黃酮類提取物對人肝L-02細胞甘油三酯蓄積及SREBP-1c表達的影響

李 熠1,匡穩(wěn)定2,周容容2,桂慶軍1,匡雙玉2*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院)

目的 觀察山銀花黃酮類提取物對人肝L-02細胞甘油三酯蓄積的影響,并初步探討SREBP-1c蛋白及基因表達在其中的作用。 方法 油紅O染色初步觀察山銀花黃酮類提取物對脂變?nèi)烁蜭-02細胞中脂滴形成的影響。然后以脂變?nèi)烁蜭-02細胞為模型,不同濃度(0、5、10、20 mg/L)山銀花黃酮類提取物作用于細胞24 h以及10 mg/L山銀花黃酮類提取物作用于細胞不同時間(0、12、24、48、72 h),生化試劑盒測定細胞內(nèi)甘油三酯(TG)的含量,Western印跡法檢測細胞內(nèi)SREBP-1c蛋白表達變化,實時熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)SREBP-1c mRNA表達變化。 結(jié)果 山銀花黃酮類提取物顯著降低人肝L-02細胞中脂滴含量,細胞內(nèi)TG水平下降,SREBP-1c蛋白及基因表達下調(diào),且呈現(xiàn)一定的劑量和時間依賴性。 結(jié)論 山銀花中黃酮類提取物能引起人肝L-02細胞TG含量下降,且這種作用與SREBP-1c蛋白及基因表達下調(diào)有一定關(guān)系。

山銀花; 提取物; 黃酮; TG; SREBP-1c

非酒精性脂肪肝病(non-alcohol fatty liver dis- ease,NAFLD)是一種以無過量飲酒史的肝實質(zhì)細胞脂肪性變和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合癥[1-3],已成為一種危害人類健康的常見的慢性肝臟疾病。然而到目前為止,臨床尚無理想的治療藥物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明山銀花具有抗菌、解熱、抗氧化及保護肝、血管的作用,而且毒性小[4],然而其對脂肪肝的保護作用尚無文獻報道。本實驗擬在脂變?nèi)烁蜭-02細胞模型上觀察山銀花黃酮類提取物對甘油三酯蓄積的影響,同時探討在此過程中,與甘油三酯合成、轉(zhuǎn)運等密切相關(guān)的SREBP-1c蛋白與基因表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

山銀花(購于湖南隆回縣),經(jīng)中藥師鑒定為灰氈毛忍冬干燥花蕾;薄層用硅膠G,青島海洋化工廠;小牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品,1640培養(yǎng)基,Gibco;胰蛋白酶,Sigma;BCA蛋白定量試劑盒,Hyclone.Pierce;TG檢測試劑盒,上?？迫A生物工程有限公司。SREBP-1c一抗,abcam;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,TIANScript RT Kit;qPCR試劑盒,KAPA Biosystems。其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 山銀花黃酮類提取物的提取與分離

[5-6],取山銀花適量,粉碎,打磨成粉。稱取約500 g,加入4 000 mL 60%乙醇冷浸30 min,70℃水浴回流提取2次,每次1.5 h,過濾,合并濾液,乙醇減壓濃縮,得總浸膏。浸膏加水分散后,正丁醇萃取。正丁醇部分用不高于70℃的微波加熱輔助提取,微波間隙處理3次,每次15 min,減壓濃縮,冷凍干燥成粉。

粉末鑒定:外觀為黃色粉末,熔點247℃ ～280℃,鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性。TLC檢驗:藥物適量,用甲醇溶解成1 mg/mL的藥液,取20μL點樣于硅膠G薄層板上,用正丁醇-冰乙酸-水(4∶1∶2)為展開劑,晾干,置紫外燈下觀察,顯出一個黃色斑點。提示該粉末為黃酮類化合物。

1.3 人肝L-02細胞培養(yǎng)及脂變細胞模型的建立

人肝L-02細胞購自武漢大學(xué)典型物保藏中心。人肝L-02細胞在含體積分數(shù)10%的滅活胎牛血清的RPMI 1 640完全培養(yǎng)基中,置37℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。用含10%胎牛血清的1 640培養(yǎng)液調(diào)細胞密度至1×105個/mL,24 h后換入含0.1%胎牛血清的1 640培養(yǎng)液中,使細胞靜止24 h后,做相應(yīng)處理。

人肝L-02細胞達1×109時,胰酶消化,用完全培養(yǎng)基重新懸浮,并以1∶3的比例傳代,取對數(shù)生長期細胞,更換新鮮培養(yǎng)液后,按余其林法[7]在培養(yǎng)液中加入50%胎牛血清,繼續(xù)培養(yǎng)24 h至出現(xiàn)細胞內(nèi)脂滴或泡沫樣物沉積,即制成脂變肝細胞模型。將所得細胞改置于含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,使其靜止24 h后,再做相應(yīng)的處理。

1.4 實驗分組

山銀花黃酮類提取物對脂變?nèi)烁蜭-02細胞脂滴含量的影響,實驗分3組:正常組、脂變肝細胞組、山銀花黃酮類提取物給藥組;山銀花黃酮類提取物對人肝L-02細胞甘油三酯蓄積及SREBP-1c表達的影響,量效關(guān)系實驗分5組:正常組、模型4個不同濃度給藥組(0、5、10、20 mg/L),其中提取物干預(yù)組是在模型組基礎(chǔ)上再給予不同濃度山銀花黃酮類提取物處理24 h;時效關(guān)系實驗分6組:正常組、模型組 5 個不同時間給藥組(0、12、24、48、72 h),其中提取物干預(yù)組是在模型組基礎(chǔ)上再給予10 mg/L山銀花黃酮類提取物處理不同時間。

1.5 油紅O染色

將細胞培養(yǎng)于預(yù)先放有無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板,處理結(jié)束后,用 PBS沖洗蓋玻片3次,每次5 min,50%異丙醇固定1 min,油紅O染色液染色10 min,蒸餾水沖洗3次,每次1 min,蘇木素染色5 min,分色和返藍后,水性封片劑封片。顯微鏡下觀察,細胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅色,細胞核呈藍色,HPIAS-1000型圖像分析系統(tǒng)收集圖像。

1.6 細胞內(nèi)TG含量檢測

收集不同條件處理的人肝L-02細胞,加入細胞裂解液震蕩,冰上放置30 min,待細胞充分裂解,4℃,14 000 r/min離心10 min并取上清液。BCA法檢測蛋白含量,甘油-3-磷酸氧化酶法檢測TG的含量。

1.7 Western印跡檢測SREBP-1c蛋白表達

收集不同條件處理的人肝L-02細胞,三去污裂解液裂解細胞,5 000 rpm離心去除沉淀,BCA試劑測定蛋白含量,上樣緩沖液調(diào)各組蛋白濃度使各組一致,經(jīng)l0%SDS-聚丙烯酰胺凝膠,電泳2 h(積層膠80V,分離膠120 V)后電轉(zhuǎn)移(4℃,100 mA,3 h)至PDVF膜上,麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果,并確定蛋白分子量標準的位置。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h,按1∶1 000加入兔抗鼠SREBP-1c一抗,37℃孵育2 h,TBST洗3次,1∶2 000加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗,37℃孵育0.5 h,TBST洗3次后,用Western blot熒光檢測試劑盒顯影、定影。結(jié)果用圖象分析儀分析。

1.8 實時熒光定量PCR檢測SREBP-1cmRNA表達

提取不同條件處理的人肝L-02細胞總RNA,根據(jù)產(chǎn)品說明書操作。用生物分光光度計測定RNA濃度和純度。取2μg RNA樣本,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并以此為模板進行PCR擴增反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)條件按照試劑盒說明書設(shè)置。SREBP-1c擴增條件:預(yù)變性95℃,3 min;擴增:95℃ 變性3 s,60℃退火20 s,72℃延伸30 s,40個循環(huán);熔解:95℃,15 s;60℃,15 s;95℃,15 s。擴增引物由上海生工生物工程公司合成。SREBP-1c 的上游引物 5′-CGCTACCGTTCCTCTATCAAT-3′,下游引物 5′– TCTACCACTTCAGGT TTCATGC-3′;GAPDH的上游引物5′-TCTCTGCTCCTCCCTGTTCTA-3′,下游引物 5′-ACTGTGCCGTTGAACTTGC-3′.利用Applied Bio-systems ViiA7型實時熒光定量PCR儀自帶軟件ViiA 7 RUO Software 1.0進行相關(guān)數(shù)據(jù)處理,以GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-△△Ct法計算基因表達的相對變化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以表示,用 SPSS 11.0 for windows軟件作統(tǒng)計分析,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗,以P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 山銀花不同提取物對脂變?nèi)烁蜭-02細胞脂滴含量的影響

10 mg/L的山銀花黃酮類提取物作用于脂變?nèi)烁蜭-02細胞24 h后,油紅O染色法觀察細胞內(nèi)脂滴含量的變化。結(jié)果表明,正常肝細胞形態(tài)為不規(guī)則方形,細胞內(nèi)紅染少;脂變?nèi)烁蜭-02細胞較正常細胞形態(tài)變圓,細胞內(nèi)紅染多,并見明顯大脂滴沉積,給藥處理后細胞內(nèi)脂滴含量較脂變肝細胞模型組脂滴含量減少、脂滴變小,但細胞形態(tài)變化不大。見圖1。

圖1 不同藥物作用于脂變?nèi)烁蜭-02細胞油紅O染色結(jié)果

2.2 山銀花黃酮類提取物對脂變?nèi)烁蜭-02細胞TG含量的影響

以人肝L-02細胞為模型,山銀花黃酮類提取物分別以不同濃度(0、5、10、20 mg/L)作用于模型細胞24 h以及10 mg/L山銀花黃酮類提取物分別作用于模型細胞不同時間(0、12、24、48、72 h)后,細胞內(nèi)TG水平呈現(xiàn)一定的劑量和時間依賴性下降趨勢,見圖2、圖 3。

2.3 山銀花黃酮類提取物對脂變?nèi)烁蜭-02細胞SREBP-1c蛋白及mRNA表達的影響

以人肝L-02細胞為模型,山銀花黃酮類提取物分別以不同濃度(0、5、10、20 mg/L)作用于模型細胞24 h以及10 mg/L山銀花黃酮類提取物分別作用于模型細胞不同時間(0、12、24、48、72 h)后,細胞內(nèi)SREBP-1c蛋白質(zhì)及mRNA表達呈現(xiàn)一定的劑量和時間依賴性下降趨勢。見圖4～圖7。

3 討 論

圖2 山銀花黃酮類提取物對脂變?nèi)烁蜭-02細胞作用24 h細胞內(nèi)TG水平影響的量效變化

圖3 10 mg/L山銀花黃酮類提取物對脂變?nèi)烁蜭-02細胞TG水平影響的時效變化

圖4 山銀花黃酮類提取物對脂變?nèi)烁蜭-02細胞SREBP-1c蛋白表達影響的量效變化(n=3)

目前歐美發(fā)達國家NAFLD患病率占平均人口的20%左右,國內(nèi)NAFLD的發(fā)病率占一般人群的10%～16%。經(jīng)治療的單純性脂肪肝可逐漸發(fā)展為炎癥細胞浸潤、壞死、纖維化,并可導(dǎo)致肝細胞癌變[1-3]。而對于NAFLD的藥物治療多處于探索階段,目前臨床尚無理想的治療藥物。臨床上常用的藥物主要有血脂調(diào)節(jié)藥、胰島素增敏劑等[8],但它們的長期使用也常易引起肝損傷。因此研發(fā)既能逆轉(zhuǎn)脂肪肝,又能對肝臟具有一定保護作用的藥物具有積極的臨床價值。

圖5 山銀花黃酮類提取物對脂變?nèi)烁蜭-02細胞SREBP-1c蛋白表達影響的時效變化

圖6 山銀花黃酮類提取物對脂變?nèi)烁蜭-02細胞SREBP-1c mRNA表達影響的量效變化

圖7 山銀花黃酮類提取物對脂變?nèi)烁蜭-02細胞SREBP-1c mRNA表達影響的時效變化

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,山銀花具有抗菌、解熱、抗氧化及保護肝、血管的作用,而且毒性小。文獻報道,忍冬科植物的化學(xué)成分主要有四類:綠原酸、苷類、黃酮類及揮發(fā)油類,本文從灰氈毛忍冬中提取分離出了黃酮類成分,初步試驗證明山銀花黃酮類提取物調(diào)節(jié)脂變肝細胞內(nèi)脂質(zhì)含量作用顯著,且本實驗首次發(fā)現(xiàn)山銀花黃酮類提取物對脂變?nèi)烁蜭-02細胞TG蓄積的改善作用,為從山銀花中開發(fā)防治脂肪肝新藥提供了一定的理論依據(jù)。

NAFLD的發(fā)病機制至今尚未明確,其中脂代謝異常被認為是最關(guān)鍵和基礎(chǔ)的環(huán)節(jié)之一,而固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol-regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)是肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控者[9]。SREBP-1c主要在嚙齒類動物和人類的肝臟和脂肪細胞表達,激活SREBP-1c不僅促進肝臟脂肪酸和甘油三酯的合成,還抑制甘油三酯的轉(zhuǎn)運[10-12]。

本文研究發(fā)現(xiàn)山銀花黃酮類提取物下調(diào)脂變?nèi)烁蜭-02細胞TG含量的同時,細胞內(nèi)SREBP-1c蛋白與基因表達亦下調(diào)。說明山銀花黃酮類提取物對脂變?nèi)烁蜭-02細胞TG蓄積的改善作用,其機制可能與下調(diào)SREBP-1c基因與蛋白表達有關(guān),為進一步研究山銀花黃酮類提取物調(diào)節(jié)脂變肝細胞脂質(zhì)代謝提供了一定的實驗基礎(chǔ)和研究方向。

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Effects of Flavonoid Extract from Flos Lonicerae Confusae on Triglyceride Accumulation and SREBP-1c Expression in Human Hepatocyte

LI Yi,KUANG Wending,ZHOU Rongrong,et al
(Medical College,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

Objective To observe the effect of lavonoid extract from Flos Lonicerae Confusae on the triglyceride accumulation in human L-02 hepatocyte,and to investigate the effect of the protein and mRNA expression of SREBP-1c in this process. Method The effect of the lavonoid extracted from Flos Lonicerae Confusae on lipid-loaded human L-02 hepatocyte,and the lipid droplet density in cells is observed by oil red Ostaining.Then the lavonoid extracted from Flos Lonicerae Confusae of different density(0,5,10,20 mg/L for 24 h)and different time(0,12,24,48,72 hours of 10 mg/L)had effects on lipid-loaded human L-02 hepatocyte,the level of triglyceride was dected by using 3-glycerol phosphate oxidase method,and the protein and mRNA expression of SREBP-1c was dected by Western blot and real-time quantitative PCR.

Results Flavonoid extract from Lonicerae Confusae had effects onipid-loaded human L-02 hepatocyte,the lipid droplet density decreases in cells,the level of triglyceride decreased,the protein and mRNA expression of SREBP-1c were downregulated,in a dose and time-dependent manner. Conclusion The lavonoid extract from Lonicerae Confusae can degradete the level of triglyceride in lipid-loaded human L-02 hepatocyte,and the possible mechanism is related to the down-regulation of SREBP-1c expression.

Lonicerae Confusae; extracts; flavone; triglyceride; SREBP-1c

R575.5

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.02.006

2014-04-24;

2015-02-05

本課題受衡陽市2012年科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃項目(No.2012KJ8)及2013年湖南省教育廳優(yōu)秀青年科研項目(2013B098)資助.

*通訊作者,E-mail:kuangshuangyu@163.com.

(此文編輯:蔣湘蓮)