基于漫反射可見光譜無損檢測生鮮牛肉和豬肉肌紅蛋白

潘 嘹，董 迪，盧立新，*

(1.江南大學 機械工程學院， 江蘇 無錫 214122；2.江蘇省食品先進制造裝備技術重點實驗室， 江蘇 無錫 214122)

生鮮肉及其制品是人類膳食的重要組成部分，其色澤是衡量品質的重要指標之一，是消費者關注的重點，肉色主要由肉中肌紅蛋白相對質量分數(shù)及存在狀態(tài)決定。貯藏過程中，肉中脫氧肌紅蛋白和氧合肌紅蛋白逐漸轉化成高鐵肌紅蛋白，生鮮肉逐漸由鮮紅色轉變?yōu)楹稚?，最終腐敗變質[1-3]。因此，檢測肌紅蛋白相對質量分數(shù)對評估生鮮肉品質至關重要。圍繞肌紅蛋白的檢測方法研究，Mancini等[4]采用K/S比率法測定，但其反射衰減比和極限值會導致誤差，為此，Krzywicki[5]提出應用可見光分光光度計測量473、525、572、730 nm處的入射光投射衰減，以此計算肌紅蛋白的比例，該方法目前已成為肌紅蛋白測定的標準方法，但測定過程中需要制備樣品，無法滿足肉制品生產(chǎn)及銷售過程中實時在線檢測的需求[6-7]。

光譜無損檢測無需前處理和制備樣品，可實現(xiàn)肉制品的無損、即時、在線檢測。該方法已開始應用于豬肉、牛肉等食品的品質檢測研究[8-9]，其中光譜數(shù)據(jù)預處理及預測模型是實現(xiàn)光譜無損檢測的關鍵[10-11]。李偉等[12]利用全譜段光譜數(shù)據(jù)借助移動窗口平滑、一階差分求導和矢量歸一化預處理方法，建立線性偏最小二乘擬合模型，模型預測準確率可達93.39%。姜沛宏等[13]應用非線性神經(jīng)網(wǎng)絡建立牛肉新鮮度分級模型，克服了線性模型的局限性，模型預測準確率達98.31%。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)選用全譜段光譜信息預測生鮮肉水分含量，光譜數(shù)據(jù)存在冗余信息。為減少冗余信息，Chen等[15]應用連續(xù)投影算法和深度學習堆疊自動編碼器算法提取特征光譜，獲得的預測模型比基于全波長的預測模型更為準確。

目前研究已基本實現(xiàn)肉制品多項指標的無損檢測，但采用光譜無損檢測方法檢測肉制品中肌紅蛋白含量的研究未見報道。文章提出一種采用漫反射可見光譜定量檢測生鮮牛肉和豬肉中脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白相對質量分數(shù)的無損檢測方法，利用定義的光譜反射吸光度預測生鮮牛肉、豬肉中肌紅蛋白相對質量分數(shù)，檢測過程中無需制樣，可實現(xiàn)肌紅蛋白的無損檢測，以期為生鮮肉制品品質監(jiān)控提供技術支持。

1 模型構建

根據(jù)Krzywicki[16]研究，脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白的特征波長分別為545、565、572 nm，且3種肌紅蛋白在525 nm均有特征峰。525 nm處3種肌紅蛋白的消光系數(shù)相等，因此選定525 nm為基準波長。定義肌紅蛋白特征波長處的表面漫反射率倒數(shù)的對數(shù)為反射吸光度，見式(1)。

(1)

式(1)中，Ai為反射吸光度；Ri為反射率，%；i=525、545、565、572。

將特征波長的反射吸光度、基準波長的反射吸光度的比值作為自變量，構建肌紅蛋白相對質量分數(shù)多元線性回歸方程，見式(2)。

(2)

式(2)中，poxy為氧合肌紅蛋白的相對質量分數(shù)，%；pdeoxy為脫氧肌紅蛋白的相對質量分數(shù)，%；pmet為高鐵肌紅蛋白的相對質量分數(shù)，%；ak=0、1、2、3，bk=0、1、2、3，ck=0、1、2、3，均為模型參數(shù)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

選取生鮮牛肉和生鮮豬肉黃瓜條部位作為實驗對象，生鮮牛肉和豬肉購置于無錫某超市，將購回的整塊生鮮牛肉和豬肉黃瓜條上下左右表面切除，從中間部位切取大小尺寸一致(2 cm×2 cm×2 cm)、質量為5 g的小塊，放入PP托盤內用保鮮膜纏繞封口，將樣品隨機分為實驗組和驗證組各3組，放入4 ℃恒溫恒濕箱中分別貯藏6 d，每天分別測定實驗組和驗證組內的6個平行樣，共36個樣品，每個平行樣測定6個點，共測定216個實驗點。

PP托盤購置于無錫某超市，長寬高分別為18.5 cm×12 cm×2.5 cm，為減少托盤顏色對肉樣漫反射影響，研究采用的PP托盤為黑色。

保鮮膜采用市場上普遍使用的PE纏繞型保鮮膜，樣品貯藏時用保鮮膜封口。

2.2 儀器與設備

2.2.1光譜檢測系統(tǒng)構成

PG2000-Pro-EX型光纖光譜儀，上海復享光學股份有限公司(信噪比450∶1，分辨率1.67 nm，積分時間10 ms～120 s，波段195～1 125 nm，波長間隔0.44 nm)；Morpho通用光譜儀控制軟件、STD-WS型標準白板，上海復享光學股份有限公司；數(shù)據(jù)收集器；反射支架(304不銹鋼)，實驗室自制；EOS 80D型數(shù)碼單鏡頭反光相機，日本佳能公司；Spectra Light QC型標準多光源燈箱，美國X-rite公司。

2.2.2光譜檢測系統(tǒng)連接

將光纖光譜儀、反射支架、盛有生鮮牛肉與豬肉的黑色托盤放于標準多光源燈箱中，黑色托盤放于反射支架上(防止光纖支架陰影對光譜采集的影響)，檢測中標準多光源燈箱用黑色織物遮蓋防止環(huán)境光線對測定的影響，數(shù)據(jù)收集器在光纖輸出端采集光譜數(shù)據(jù)，數(shù)碼單鏡頭反光相機拍攝樣品形貌。光譜檢測系統(tǒng)連接方式如圖1。

1-標準多光源燈箱；2-光源；3-反射支架；4-實驗樣品；5-光纖檢測端；6-石英光纖；7-反射光譜測量支架；8-光纖光譜儀；9-三腳架；10-數(shù)碼單鏡頭反光相機；11-黑色織物；12-數(shù)據(jù)連接線；13-數(shù)據(jù)收集器；14-實驗臺。圖1 光譜檢測系統(tǒng)Fig.1 Spectral detection system

2.3 實驗方法

2.3.1漫反射光譜采集

1)設置D65光源(光源強度3 000 a·u、環(huán)境溫度25 ℃、光纖光譜儀信噪比450∶1)。

2)實驗樣品(表面溫度為4 ℃)放置在黑色托盤中，放于反射支架上，關閉室內燈光待測。

3)采集光譜，拍攝樣品形貌(光圈5.6，快門1/125 s，ISO 200)，每塊樣品測定6個點，6次平均值作為樣品反射光譜。反射光譜每天采集1次，直到肉表面呈現(xiàn)淺綠色伴有黏液，散發(fā)刺激性氣味時停止光譜采集，實驗結束。生鮮牛肉和豬肉的實驗時間均為6 d。

2.3.2可見分光光度計測定肌紅蛋白相對質量分數(shù)

研究參照Krzywicki[5]實驗方法測定肌紅蛋白相對質量分數(shù)。

1)取5 g待測樣品，加入25 mL濃度為0.04 mol/L，pH值6.8的磷酸鈉緩沖溶液。

圖2 生鮮牛肉光譜分析Fig.2 Analysis of spectrum of fresh beef

2)將加入磷酸鈉緩沖溶液的樣品在室溫下用勻漿器均質30 s，置勻漿后的均質液于4 ℃恒溫恒濕箱中保存1 h。

3)均質液于4 ℃恒溫恒濕箱取出，放入轉速為4 500 r/min的離心機中離心20 min。

4)將上清液通過濾紙過濾，用可見分光光度計測定濾液吸光度。

3 結果與分析

3.1 光譜分析

生鮮牛肉和豬肉于4 ℃恒溫恒濕箱中分別貯藏6 d，貯藏過程中生鮮牛肉和豬肉光纖光譜儀反射光譜、可見分光光度計光譜如圖2、圖3。由光纖光譜儀采集到的光譜與可見分光光度計采集到的光譜相比，生鮮牛肉和豬肉在545、565 nm處存在顯著吸收峰或反射峰。此外，隨貯藏時間增加，特征峰峰值呈現(xiàn)反射率降低、升高、降低的3個階段變化規(guī)律，反映了不同肌紅蛋白在貯藏期內的相互轉變。

3.2 肌紅蛋白相對質量分數(shù)變化

生鮮牛肉和豬肉于4 ℃恒溫恒濕箱中分別貯藏6 d，貯藏過程中生鮮牛肉、豬肉顏色變化如圖4、圖5。結果表明：隨時間推移，生鮮牛肉和豬肉的顏色由暗紅色變?yōu)轷r紅色，最終呈現(xiàn)褐色。肌紅蛋白中鐵離子的化合價態(tài)(Fe2+或Fe3+)與氧氣結合的位置是導致其色澤變化的根本原因。圖6為采用可見分光光度計測量的貯藏過程中生鮮牛肉和豬肉中脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白分別在總肌紅蛋白中的質量分數(shù)變化。

圖3 生鮮豬肉光譜分析Fig.3 Analysis of spectrum of fresh pork

圖4 生鮮牛肉顏色變化Fig.4 Color change of fresh beef

圖6 生鮮肉3種肌紅蛋白相對質量分數(shù)變化Fig.6 Changes of relative mass fraction of myoglobin in fresh meat

整個貯藏過程中，反射光譜、生鮮肉顏色、肌紅蛋白相對質量分數(shù)三者變化相互關聯(lián)[17-18]，生鮮牛肉和豬肉均在0～1 d、2～3 d、4～5 d呈現(xiàn)階段性變化，因此，將生鮮牛肉和豬肉指標變化分為3個階段。

第1階段，肌紅蛋白依靠電子傳遞鏈使鐵離子處于還原狀態(tài)，3種肌紅蛋白相互轉化，脫氧肌紅蛋白相對質量分數(shù)基本不變；脫氧肌紅蛋白轉化成氧合肌紅蛋白的速率與脫氧肌紅蛋白轉化成高鐵肌紅蛋白的速率一致，生鮮牛肉、豬肉呈現(xiàn)暗紅色，反射率降低。

第2階段，肉與空氣中的氧氣充分接觸，肌肉中二價鐵離子被氧化為三價鐵離子，脫氧肌紅蛋白相對質量分數(shù)基本不變，脫氧肌紅蛋白轉化成氧合肌紅蛋白的速率高于脫氧肌紅蛋白轉化成高鐵肌紅蛋白的速率，生鮮牛肉、豬肉呈現(xiàn)鮮紅色，反射率升高。

第3階段，生鮮牛肉和豬肉脫氧肌紅蛋白相對質量分數(shù)基本不變。生鮮牛肉氧合肌紅蛋白的相對質量分數(shù)呈下降趨勢變化，4 d后急劇下降；高鐵肌紅蛋白的相對質量分數(shù)呈上升趨勢變化，第4天時高鐵肌紅蛋白轉化成脫氧肌紅蛋白的能力消失，高鐵肌紅蛋白相對質量分數(shù)急劇上升，生鮮牛肉開始腐敗變質，呈現(xiàn)褐色，反射率降低。生鮮豬肉氧合肌紅蛋白相對質量分數(shù)呈下降趨勢變化，高鐵肌紅蛋白相對質量分數(shù)呈上升趨勢變化，第5天時高鐵肌紅蛋白相對質量分數(shù)急劇上升，生鮮豬肉開始腐敗變質，反射率降低。

3.3 模型驗證

為驗證本研究建立的預測模型，將光纖光譜儀測得的光譜反射率[圖2(a)、圖3(a)]代入式(2)構建回歸分析模型，經(jīng)回歸分析所得模型參數(shù)見表1。

表1 肌紅蛋白多元線性回歸方程模型Tab.1 Multiple linear regression equation model parameters of myoglobin

實驗值與模型預測值如圖6。為進一步評價模型精度，將實驗值與模型預測值進行線性回歸，R2值與擬合曲線見圖7、圖8，擬合方程的截距均小于10-14，斜率等于1，說明本研究提出的基于漫反射可見光譜肌紅蛋白無損檢測方法能預測生鮮牛肉和豬肉中3種肌紅蛋白相對質量分數(shù)。

圖7 生鮮牛肉肌紅蛋白預測Fig.7 Prediction chart of myoglobin in fresh beef

圖8 生鮮豬肉肌紅蛋白預測Fig.8 Prediction chart of myoglobin in fresh pork

4 結 論

基于表面漫反射可見光譜，提出了定量檢測生鮮牛肉和豬肉3種肌紅蛋白相對質量分數(shù)的方法，預測生鮮牛肉和豬肉3種肌紅蛋白質量分數(shù)，判定生鮮牛肉和豬肉的品質。檢測過程中無需制樣，對生鮮牛肉和豬肉無破壞，適用于實時在線檢測，證明了無損檢測3種肌紅蛋白預測模型在食品品質預測方面的可行性，旨在為生鮮肉流通中品質檢測提供基礎。