鴨圓環(huán)病毒PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

李金平，張富友，朱峻鋒，張 琳，劉 朔，彭 程，蔣文明，劉華雷

（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安 271018；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109）

鴨圓環(huán)病毒（duck circovirus，DuCV）屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，無囊膜，為單股、環(huán)狀、雙向DNA 病毒，呈二十面體對(duì)稱[1]。在電鏡下，其病毒粒子大小與其他圓環(huán)病毒類似，直徑為15～16 nm。Hattermann 等[1]于2003 年首次報(bào)道DuCV 感染；2006 年和2008 年，我國分別在臺(tái)灣地區(qū)和大陸檢測到DuCV。目前，DuCV 在世界主要養(yǎng)鴨區(qū)流行較為普遍[2-6]。

我國是養(yǎng)鴨大國，鴨飼養(yǎng)量占世界的70%以上。流行病學(xué)調(diào)查[1]顯示，DuCV 在我國鴨群中普遍存在，可以感染各個(gè)品種的鴨子，包括櫻桃谷鴨、麻鴨、番鴨、半番鴨等多個(gè)品種。該病一年四季均可發(fā)病，無明顯季節(jié)性，主要表現(xiàn)為發(fā)育狀況差、羽毛營養(yǎng)失調(diào)、生長遲緩或停滯。DuCV 感染鴨群后易誘發(fā)群體免疫抑制，使鴨瘟、鴨病毒性肝炎、鴨傳染性漿膜炎、鴨巴氏桿菌病、大腸桿菌病等鴨常見病的發(fā)病率上升并加重此類疫病的致病性，導(dǎo)致感染鴨群出現(xiàn)病原的多重混合感染（或繼發(fā)感染），是我國鴨群流行的主要免疫抑制病病原。

對(duì)DuCV 全基因組遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，DuCV可分為DuCV-1 和DuCV-2 兩種基因型[7]。本研究根據(jù)DuCV-1 和DuCV-2 的基因組保守區(qū)序列特征，建立僅需1 對(duì)PCR 引物即可同時(shí)檢測DuCV-1 和DuCV-2 的PCR 方法，以期減少檢測工作量，為進(jìn)一步開展DuCV、診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供新的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 病料及病毒株

臨床發(fā)病鴨組織病料（20 份），采自山東濰坊、濟(jì)寧、聊城、臨沂等地的櫻桃谷鴨養(yǎng)殖場；禽流感病毒（H5N6 亞型DK/SD/WF/2019、H9N2亞型DK/SD/LY/2019）、鴨坦布蘇病毒（DK/SD/814/2019）、禽腺病毒（C4 血清型DK/SD/LY/2020）、鴨呼腸孤病毒（DK/SD/YN10/2020）以及鴨細(xì)小病毒（DK/SD/LY/2017），均由本實(shí)驗(yàn)室從臨床病例中分離保存。

1.2 主要試劑

病毒DNA/RNA 核酸純化試劑盒，購自旭基公司；2×TaqPlus Master Mix、HiScript II One Step RT-PCR Kit，購自Vazyme 公司。

1.3 遺傳進(jìn)化分析

下載GenBank 數(shù)據(jù)庫中登錄的130 條DuCV全基因組序列，利用MEGA5軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1.4 序列比對(duì)及引物設(shè)計(jì)

利 用MegAlign 軟 件 對(duì)DuCV 全 基因組序列進(jìn)行比對(duì)，選擇兩個(gè)基因型DuCV 共同保守區(qū)設(shè)計(jì)3 對(duì)引物（F1/R1：5'-CCTTGAGGAGTCGCTGGGAGGA-3'/5'-CCACGCCCAAAGATAACATAAGTC-3'；F2/R2：5'-ACCGGCGCTTGTACTCCG-3'/5'-CCACGCCCAAAGATAACATAAGTC-3'；F3/R3：5'-TTGAGGAGTCGCTGGGAGGA-3'/5'-GACGACTACGTCATTTCCCG-3'），對(duì)兩個(gè)基因型均分別擴(kuò)增228、476、410 bp。

1.5 PCR 檢測方法建立

根據(jù)病毒DNA/RNA 核酸純化試劑盒操作說明書，提取已知DuCV 陽性鴨病料核酸，然后用無核酸酶水作10 倍倍比稀釋。利用倍比稀釋的核酸模板對(duì)設(shè)計(jì)的3 對(duì)引物進(jìn)行篩選評(píng)估。采用25 μL PCR 反應(yīng)體系：2×TaqPlus Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，10 倍倍比稀釋的核酸模板3 μL，水7.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。經(jīng)Qiagen QIAxcel 毛細(xì)管電泳分析后，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，然后送青島志遠(yuǎn)生物工程有限公司測序。

1.6 特異性檢測

提取禽流感病毒（H5N6、H9N2）、鴨坦布蘇病毒、禽腺病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨細(xì)小病毒基因組作為檢測模板，以DuCV 核酸為陽性對(duì)照，利用建立的PCR方法分別檢測上述常見鴨病病原，評(píng)估該方法的特異性。

1.7 敏感性檢測

測定核酸濃度，將提取的核酸用無核酸酶水作10 倍倍比稀釋。利用引物對(duì)F3/R3 建立的PCR方法進(jìn)行檢測，評(píng)估該方法的敏感性。

1.8 臨床應(yīng)用

使用病毒DNA/RNA 核酸純化試劑盒，對(duì)2020 年收集的20 份臨床發(fā)病鴨組織樣品提取基因組DNA，利用建立的PCR 方法進(jìn)行檢測，并對(duì)檢測陽性樣品進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DuCV 遺傳進(jìn)化分析

利用MEGA5 軟件對(duì)GenBank 數(shù)據(jù)庫中的DuCV 全基因組序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果（圖1）顯示，DuCV 可以分為兩種基因型：DuCV-1 和DuCV-2，與Zhang 等[4]分析結(jié)果一致。

圖1 DuCV 全基因組序列遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

2.2 引物篩選與驗(yàn)證

利用10 倍倍比稀釋的核酸模板對(duì)設(shè)計(jì)的3 對(duì)引物進(jìn)行篩選。從圖2 可以看出，引物對(duì)F3/R3 可以檢測到103倍倍比稀釋的核酸，敏感性高于引物對(duì)F1/R1 和引物對(duì)F2/R2，因此選擇引物對(duì)F3/R3，其位置見圖3。

2.3 特異性試驗(yàn)

利用建立的PCR 方法分別對(duì)禽流感病毒（H5N6、H9N2）、鴨坦布蘇病毒、禽腺病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨細(xì)小病毒核酸進(jìn)行檢測，結(jié)果該方法只能對(duì)應(yīng)擴(kuò)增DuCV 核酸，而對(duì)其他病毒核酸擴(kuò)增均為陰性（圖4），表明該方法具有良好的特異性。

圖2 引物對(duì)篩選結(jié)果

圖3 引物對(duì)F3/R3 的位置

2.4 敏感性試驗(yàn)

從圖2 可以看出，利用引物對(duì)F3/R3 建立的PCR方法檢測下限為1.0 fg/mL（103倍稀釋）的核酸。

2.5 臨床樣品檢測

用上述PCR 檢測方法對(duì)20 份臨床發(fā)病組織樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有6 份DuCV 陽性樣品（圖5）。將陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送青島志遠(yuǎn)生物工程有限公司測序，經(jīng)BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)發(fā)病樣品中的DuCV 均屬于DuCV-1 型。

圖4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖5 臨床樣品檢測結(jié)果

3 討論

近年來，新的鴨病不斷出現(xiàn)，如2010 年左右出現(xiàn)的鴨坦布蘇病[8]，2015 年左右出現(xiàn)的鴨短喙侏儒綜合征[9]；老的鴨病依然存在，如禽流感、大腸桿菌病、鴨疫里默氏桿菌病等。這些疫病給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了極大挑戰(zhàn)。

鴨圓環(huán)病毒病是近年來影響?zhàn)B鴨業(yè)的一種重要免疫抑制病。該病既可水平傳播，又可垂直傳播。DuCV 感染后侵害宿主免疫系統(tǒng)，使其免疫力降低，且常與其他病原混合或繼發(fā)感染，從而加重其臨床危害。

遺傳進(jìn)化顯示，DuCV 分為DuCV-1 和DuCV-2 兩種基因型。這種基于全基因組序列分析的結(jié)果與分別基于Cap和Rep基因分型的結(jié)果是一致的[10]。為了快速檢測DuCV，通過序列比對(duì)，本研究選擇不同的保守區(qū)設(shè)計(jì)了3 對(duì)引物。試驗(yàn)結(jié)果表明，引物對(duì)F1/R1 和引物對(duì)F2/R2 僅能檢測到100 倍稀釋的核酸（10.0 fg），而引物對(duì)F3/R3 可以檢測到1 000 倍稀釋的核酸（1.0 fg），且引物對(duì)F1/R1 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，所以本方法選取引物對(duì)F3/R3 作為檢測引物。該引物對(duì)具有良好的特異性，僅能擴(kuò)增出DuCV-1 和DuCV-2，對(duì)H5N6、H9N2、鴨坦布蘇病毒、禽腺病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨細(xì)小病毒等病毒核酸反應(yīng)均呈陰性。現(xiàn)有檢測方法，多是分別檢測DuCV-1 或DuCV-2 的PCR 方法，需要進(jìn)行兩次PCR 反應(yīng)或多重PCR 才能完成檢測[11-12]。而本方法可以同時(shí)擴(kuò)增DuCV-1 和DuCV-2，并進(jìn)一步通過測序可以區(qū)分不同的基因型。臨床試驗(yàn)表明，2020 年上半年檢測到的6 份DuCV 均為DuCV-1 基因型。本研究建立的DuCV PCR 檢測方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于鴨圓環(huán)病毒病的流行病學(xué)調(diào)查、監(jiān)測、早期診斷和有效防控具有重要意義。