檢驗用大腸桿菌K88纖毛抗原的純化及其單因子血清制備與質量控制方法研究

彭國瑞， 蔣 菲， 王秀麗， 彭小兵， 李 建， 李旭妮， 李俊平， 張 媛

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所， 北京海淀100081 ； 2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院， 北京海淀100193 ； 3.中國動物疫病預防控制中心， 北京大興102600)

目前，我國用于預防仔豬黃痢的疫苗有仔豬大腸埃希菌病三價滅活疫苗和仔豬大腸桿菌病(K88、K99、987P)、產氣莢膜梭菌病(C型)二聯滅活疫苗等，年產量約380萬頭份。這類疫苗的效力檢驗主要采用反向間接血凝試驗(RIHA)測定大腸桿菌K88、K99和987P纖毛抗原的RIHA效價，該方法需使用相應纖毛抗原單因子血清[1]，國外采用的ELISA方法也需要纖毛抗原多克隆抗體和單克隆抗體[2]。但現有方法[3-4]制備這3種單因子血清要求抗原純度高、免疫抗原劑量大，同時也存在血清效價不易提高、質量不易穩(wěn)定控制的問題。因此，研究一種效價高、特異性好、制備方法簡便、質量可控的纖毛抗原單因子血清標準品，對于提高疫苗檢驗結果的一致性和穩(wěn)定性都十分必要。本研究通過高密度發(fā)酵獲得了仔豬大腸桿菌培養(yǎng)物，優(yōu)化了K88纖毛抗原的純化方法，制備了免疫血清，并對制備過程進行質量控制，為獸用生物制品檢驗用標準品的研制提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種 仔豬大腸桿菌滅活疫苗檢驗用含K88纖毛抗原的大腸桿菌CVCC196(C83902)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。

1.2 試劑 改良Minca瓊脂、改良Minca肉湯干粉、PBS緩沖液，均由北京中海生物科技公司提供；BCA蛋白定量試劑盒，購自北京康為世紀公司；K88、K99、987P纖毛抗原單因子陽性血清、弗氏佐劑，均由本實驗室制備；甘油、檸檬酸、硫酸氨、脫氧膽酸鈉(Na-DOC)等為國產或進口試劑純。

1.3 儀器和設備 生物反應器(Applicon，ez-control & 7 L Autoclavable Bioreactor)、Waring組織搗碎機24CB10、紫外分光光度計(SPECTRA max，384 plus)等。

1.4 實驗動物 體重1.5～2.0 kg大耳白兔，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.5 方法

1.5.1 生物反應器發(fā)酵培養(yǎng) 將菌種CVCC196劃線接種改良Minca瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)20 h。選取若干典型菌落接種400 mL改良Minca肉湯，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，作為發(fā)酵種子液。在生物反應器中加入含5%甘油的改良Minca肉湯3.5 L高壓滅菌后，設定發(fā)酵溫度37 ℃，pH 7.0(用氨水調節(jié)pH)，攪拌速度500～580 r/min，溶氧120%，通空氣量15 L/min，待控制系統(tǒng)穩(wěn)定后，接種380 mL種子液。以含12.5%葡萄糖、12.5%胰蛋白胨400 mL作為補料液緩慢補料，1 h內補充完畢。取樣測定發(fā)酵菌液OD600 nm吸光值，用K88單因子陽性血清做平板凝集試檢測細菌的生長和纖毛抗原的表達。

1.5.2 K88纖毛抗原的粗提取 將收獲的發(fā)酵菌液8 000 g離心30 min，棄上清，沉淀用0.01 mol/L pH 7.2的PBS懸浮至原體積，重復離心懸浮3次。加入組織搗碎機，21 500 r/min，3 min/次，間隔2 min， 處理3次以上，取小量樣品離心，將沉淀回復原體積，用K88單因子陽性血清做平板凝集試驗至離心沉淀弱凝集或不凝集。收集處理后菌液28 000 g離心30 min，棄沉淀，上清即為K88纖毛抗原粗提取物，SDS-PAGE檢測。

1.5.3 K88纖毛抗原的純化 (1)檸檬酸等電點沉淀：取纖毛抗原粗提取物邊攪拌邊緩慢滴加檸檬酸至pH 4.0，4 ℃靜置沉淀16 h，14 000 g離心15 min， 棄上清，沉淀用1/10體積PBS復溶，SDS-PAGE檢測；(2)硫酸銨鹽析飽和度的確定：在纖毛抗原粗提取物中分別加入室溫保存的飽和硫酸銨溶液至10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%飽和度，4 ℃靜置沉淀16 h，15 000 g離心30 min，棄上清，沉淀用PBS溶解至原體積的1/10，SDS-PAGE檢測；(3)檸檬酸與硫酸銨組合純化：取纖毛抗原粗提取物邊攪拌邊緩慢滴加檸檬酸至pH 4.0，4 ℃靜置沉淀16 h，14 000 g離心15 min，棄上清，沉淀用PBS復溶至原體積，再加檸檬酸至pH 4.0，4 ℃靜置沉淀2 h，離心棄上清，沉淀用PBS復溶。所得溶液加飽和硫酸銨溶液至20%飽和度，4 ℃靜置沉淀16 h， 15 000 g 離心30 min棄沉淀，測定上清體積，補加飽和硫酸銨溶液至30%飽和度，15 000 g離心 60 min，沉淀用PBS溶解至原體積的1/20；(4)Doc處理與蛋白濃度測定：上述(3)中所得蛋白溶液用0.5% Na-DOC(0.5%DOC-0.05 mol/L pH 7.6 PB)37 ℃透析48 h，14 000 g離心30 min，棄沉淀，上清用0.02 mol/L pH 7.4 PB 4 ℃透析48 h。瓊脂擴散試驗檢測純化抗原的反應原性，以純化蛋白為抗原加入瓊脂擴散試驗中央孔，將K88、K99、987P纖毛抗原單因子血清以及PBS溶液對照加入周圍各孔。BCA法測定蛋白質濃度，SDS-PAGE檢測蛋白的純度。

1.5.4 K88單因子血清的制備 (1)免疫程序：取家兔4只，一免濃度為1 mg/mL纖毛抗原蛋白與弗氏完全佐劑等體積混勻乳化后，1 mL/只后肢兩足墊內注射免疫；2周后二免，纖毛抗原蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混勻乳化，1.5 mL/只背部皮下多點注射免疫；一免4周后三免，纖毛抗原蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混勻乳化，2 mL/只后肢肌肉注射免疫。(2)血清效價測定：免疫前、每次免疫后采血，分離血清，以濃度為1.5 mg/mL K88纖毛純化蛋白為抗原，測定免疫后血清瓊脂擴散效價[5]。

2 結果

2.1 生物反應器發(fā)酵培養(yǎng) 生物反應器控制系統(tǒng)啟動穩(wěn)定1 h后接種，7 h內溶氧量保持在96%上下，到7 h取樣菌液OD600 nm為2.784，補料后，溶氧量迅速下降，10.5 h左右溶氧量迅速上升(見中插彩版圖1)，11 h收獲，菌液OD600 nm為14.208，用K88單因子血清做平板凝集試驗檢測強凝集。結果表明，大腸桿菌高密度生長，K88抗原得到表達。

2.2 K88纖毛抗原的粗提取 機械脫纖處理后，平板凝集試驗顯示，菌體與K88單因子血清不能凝集；SDS-PAGE檢測顯示，離心上清含有與預期纖毛抗原分子大小相當的蛋白質(圖2)，表明機械攪拌可以使纖毛抗原脫落。

圖2 SDS-PAGE分析K88纖毛粗提取物Fig.2 Analysis of K88 crude extract by SDS-PAGEM：蛋白質marker； 1：K88纖毛粗提取物M:Protein marker; 1:K88 crude extract

2.3 K88纖毛抗原的純化

2.3.1 檸檬酸等電點沉淀 取纖毛抗原粗提取物用檸檬酸沉淀后SDS-PAGE檢測結果見圖3，與圖2比較可見檸檬酸沉淀后除去了部分雜質蛋白。

圖3 SDS-PAGE分析檸檬酸沉淀K88纖毛抗原Fig.3 Analysis of citric acid precipitation product of K88 by SDS-PAGEM：蛋白質marker； 1：K88纖毛抗原檸檬酸沉淀產物M:Protein marker; 1:K88 precipitation product by citric acid

2.3.2 硫酸銨鹽析飽和度的確定 10%、20%飽和度硫酸銨對K88纖毛抗原的鹽析作用弱，但對雜質蛋白有沉淀作用，30%、40%飽和度硫酸銨對K88纖毛抗原的鹽析作用強，50%及以上飽和度硫酸銨會有更多的雜質蛋白與K88纖毛抗原同時沉淀(圖4)。因此，采用兩步沉淀純化，首先用20%飽和度硫酸銨沉淀去除雜質蛋白，繼續(xù)用30%飽和度硫酸銨沉淀K88纖毛抗原蛋白，可達到提純的目的。

圖4 不同飽和度硫酸銨對K88纖毛抗原的沉淀Fig.4 K88 precipitated by ammonium sulfate of different saturationM：蛋白質marker； 1～8：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%飽和度硫酸銨沉淀K88纖毛抗原M:Protein marker; 1～8：K88 precipitated by ammonium sulfate of 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70% and 80% saturation

2.3.3 檸檬酸與硫酸銨組合純化以及DOC處理 經檸檬酸、硫酸銨組合純化以及DOC處理后,瓊脂擴散試驗檢測，純化抗原能夠與K88單因子血清發(fā)生反應，與K99、987P單因子血清不發(fā)生反應。BCA法測定蛋白濃度為1.5 mg/mL。SDS-PAGE檢測結果如圖5所示，可見1條明顯條帶，分子大小與K88纖毛蛋白預期大小一致，灰度掃描分析純度約為85%。

2.4 免疫血清效價的測定 提純的K88纖毛抗原免疫家兔3次，免疫后采血，瓊脂擴散試驗測定血清效價，免疫前家兔血清與K88不發(fā)生反應，免疫3次后血清效價最高可以達到1∶128(表1)。

3 討論

對于K88的純化報道較多的是使用硫酸銨鹽析沉淀[3]或結合柱層析[6-7]，或采用等電點酸沉淀結合柱層析[4]等方法，但這些方法或是純化過程簡便，抗原純度相對不高，或是純化過程復雜，蛋白純度高，損失卻較大，純化產率偏低，一定程度上限制了免疫血清制備。本研究通過檸檬酸等電點沉淀和硫酸銨鹽析比較發(fā)現，單獨使用合適飽和度的硫酸銨鹽析較檸檬酸等電點沉淀在純化得率和去除雜質蛋白方面都較為優(yōu)越[8]，但檸檬酸沉淀可以去除樣品體系中硫酸銨鹽析沉淀不掉的部分蛋白，基于以上結果，本試驗確定第一步采取檸檬酸等電點沉淀，第二步采用20%飽和度硫酸銨梯度鹽析沉淀去除雜質蛋白，在提高硫酸銨飽和度到30%沉淀收獲目的蛋白，提高了蛋白的純度和得率，經計算，每升發(fā)酵培養(yǎng)菌液能夠獲得提純抗原33.3 mg，方法簡化，可重復性強，適合大批量純化。采用SDS-PAGE、蛋白濃度測定和陽性血清瓊脂擴散試驗對抗原質量進行了控制。

圖5 SDS-PAGE分析純化后的K88纖毛抗原Fig.5 Analysis of purified K88 by SDS-PAGEM：蛋白質marker； 1：BSA； 2：純化后的K88纖毛抗原M:Protein marker; 1:BSA; 2:Purified K88 citric antigen

表1 家兔免疫血清效價Table 1 Titers of rabbit antiserum

在纖毛抗原制備方法上，除采用傳統(tǒng)方法提純外，用基因工程表達的方法制備重組纖毛抗原已經用于亞單位疫苗，也可以將其應用于免疫血清制備的研究報道[9]。通過基因工程表達和重組蛋白質純化技術，可以提高纖毛抗原的產量，簡化純化步驟，提高抗原純度。

由于產腸毒素大腸桿菌(ETEC)的致病作用與粘附性纖毛和腸毒素密切相關，ETEC菌株是通過纖毛與宿主小腸上皮細胞表面的相應受體結合，從而在該局部組織粘附、定居、繁殖和產生毒素，導致腹瀉。引起仔豬腹瀉的纖毛抗原主要是 K88、K99、987P 和 F41。纖毛抗原具有良好的免疫原性，免疫機體后能產生相應的纖毛抗體，對產腸毒素大腸桿菌具有免疫作用。因此，可以利用本方法易于大批量純化的特點，進一步提純制造疫苗用的纖毛抗原，制成純度更高，更安全的疫苗。