肝細胞癌進展過程中的關(guān)鍵基因ATP1B3和ENAH的篩選與鑒定：基于數(shù)據(jù)挖掘和臨床驗證

肝細胞癌（HCC）是一個主要的全球健康問題和死 亡原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，到2030年，將有超過100 萬人死于HCC，與其他癌癥相比，HCC 發(fā)病率在2020年繼續(xù)以更快的速度上升。這種癌癥的主要病因包括代謝紊亂、肝炎病毒的慢性感染、吸煙和過量飲酒等。不管肝臟的病因如何，HCC與肝纖維化和肝硬化密切相關(guān)。HCC預(yù)后的一個重要部分取決于潛在的慢性肝病，這也是其發(fā)生的危險因素。肝硬化死亡率的Child-Pugh評分對于患者分層至關(guān)重要。大約80%～90%的HCC有潛在肝纖維化，大約三分之一的肝硬化患者會發(fā)展成HCC。由于早期臨床癥狀不明顯，發(fā)病機制不明，HCC確診時通常為晚期或已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，增加治療難度，且預(yù)后較差。目前，常用的HCC診斷方法，如血清腫瘤標志物、影像學技術(shù)等臨床效果并不理想。篩選與HCC早期診斷和不良預(yù)后相關(guān)的標志物，對于提高HCC的治療效果和預(yù)后至關(guān)重要。隨著多組學分析方法的應(yīng)用，大量重要分子被發(fā)現(xiàn)并成功應(yīng)用于臨床診斷和治療。但是，從肝纖維化進展到HCC是一個漫長的過程，其機制非常復(fù)雜，目前尚未發(fā)現(xiàn)能作為HCC進程的標記物。因此，我們通過生物信息學數(shù)據(jù)挖掘，著眼于HCC進程中各疾病表型之間的基因變化，找到與HCC進展相關(guān)的新基因，以期作為HCC的診斷和預(yù)后的新靶點。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)集選擇

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載374 個HCC 和50 個正常組織的表達譜，從GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/database）獲取HBV相關(guān)肝纖維化患者基因表達譜數(shù)據(jù)集GSE84044、正常與肝硬化相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE14323、肝硬化與HCC相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE63898。其中GSE84044數(shù)據(jù)集基于GPL570平臺［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array、GSE14323數(shù)據(jù)集基于GPL571平臺［HG-U133A_2］Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array、GSE63898數(shù)據(jù)集基于GPL13667平臺［HGU219］Affymetrix Human Genome U219 Array。

1.2 DEG的篩選

TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集的DEG使用edge R包分析，GSE84044、GSE14323和GSE63898數(shù)據(jù)集的DEG使用在線工具GEO2R來識別。選擇＜0.05，|FC|＞2作為TCGA-LIHC、GSE14323和GSE63898數(shù)據(jù)集DEG的截斷值，＜0.05，|FC|＞1.3作為GSE84044 數(shù)據(jù)集DEG的截斷值。

1.3 DEG的火山圖、韋恩圖繪制

使用ggplot2 R包繪制火山圖和韋恩圖。

1.4 DEG的富集分析

使用clusterProfiler R包對差異基因繪制GO分析，包括生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）以及KEGG通路分析。＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.5 基因的差異表達和臨床參數(shù)相關(guān)性分析

GO富集分析顯示差異基因主要富集在細胞外結(jié)構(gòu)組織，含細胞外基質(zhì)的膠原蛋白，細胞外基質(zhì)成分等方面。KEGG富集顯示主要富集在黏著斑途徑中（圖2）。

1.6 RT-qPCR

本研究使用GEO2R分別對GSE84044數(shù)據(jù)集中肝纖維化組織、GSE14323數(shù)據(jù)集中正常與肝硬化組織、GSE63898數(shù)據(jù)集中肝硬化與HCC組織；使用edgeR包對TCGA-LIHC中正常與HCC組織按篩選標準（FC=1.3/2，＜0.05）進行差異基因分析（表1），分別得到了1972，912，1107，8975個DEG。使用火山圖對各數(shù)據(jù)集差異基因進行可視化（圖1A～D），取交集后得到了118個共同DEG（圖1E）。

2 結(jié)果

2.1 不同肝臟相關(guān)疾病組別共同DEG篩選

收集來自廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院15對HCC組織和鄰近癌旁組織。采樣時間為2018年6月～2020年9 月。本研究獲得廣西醫(yī)科大學倫理委員會批準（20200035）。所有患者均提供知情同意。Trizol試劑提取HCC組織和癌旁組織中的總RNA。用Takala反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用Takala試劑盒（RR820A）進行RT-qPCR擴增。引物序列：ATP1B3正向5'-TCATCTACAACCCGACCACCG-3'，反向5'-GAGTCTGAAGCATAACCCACATC-3'；ENAH正向5'-TGACTATTGTGCTGTCTGCTGC-3'，反向5'-AAAGGTTCACTGCTGACTCCC-3'；ACTB 正 向5'-AGATCAAGATCATTGCTCCTCCTG-3'，反向5'-AG TCATAGTCCGCCTAGAAGCAT-3'。ATP1B3和ENAH的檢測以β-Actin 作為內(nèi)參。2法計算ATP1B3 和ENAH的相對表達水平。

2.2 DEG的富集分析

使用Wilcoxon 秩和檢驗對基因在各不同疾病類型中進行差異表達分析；基因與臨床特征關(guān)系分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗或Fisher's精準檢驗，連續(xù)資料采用檢驗；使用logrank檢驗對基因在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中進行生存分析，使用survminer包對生存結(jié)果進行可視化；使用pROC包繪制基因關(guān)于預(yù)測正常和腫瘤結(jié)局的ROC曲線圖；使用單因素方差分析分析基因表達量與T分期、病理Stage和病理Grade關(guān)系，使用ggplot2 R包進行可視化。

ATP1B3 表達與T 分期和臨床病理分期相關(guān)（＜0.05），而ENAH表達與病理分級相關(guān)（＜0.05，表3）。生存分析發(fā)現(xiàn)，ATP1B3和ENAH高表達與HCC患者不良預(yù)后有關(guān)（＜0.05，圖4A、B）。ROC曲線分析表明ATP1B3 和ENAH，曲線下面積AUC 分別是0.821 和0.933，在預(yù)測患者為正?；蚰[瘤結(jié)局檢驗效能方面具有較高準確性（圖4C、D）。接著我們分析了ATP1B3和ENAH的表達量與臨床各分期和分級關(guān)系。從T分期、病理Stage和病理Grade來看，ATP1B3表達隨著HCC疾病進展表達量逐漸升高。T3、T2分期ATP1B3表達量顯著高于T1分期，Stage III、Stage II高于Stage I分期，Grade3分級高于Grade1（＜0.05，圖4E～G）。ENAH高表達與HCC晚期病理Grade相關(guān)，Grade3、Grade2分級ENAH表達量顯著高于Grade1（＜0.05，圖4H～J）。

2.3 篩選DEG的核心基因

在本研究中，我們篩選了GEO數(shù)據(jù)庫中3個數(shù)據(jù)集：肝纖維化數(shù)據(jù)集GSE84044、肝硬化相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE14323、肝硬化與HCC 相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE63898 和TCGA中肝細胞癌TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集。取四個數(shù)據(jù)集DEG交集，我們獲得了118個共同DEG。對DEG做GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)DEG在細胞外基質(zhì)組織、膠原蛋白三聚體、糖胺聚糖結(jié)合、黏著斑和AGE-RAGE通路中起重要作用。我們發(fā)現(xiàn)在上調(diào)基因中發(fā)現(xiàn)ROBO1、LAMC1、ATP1B3、SPP1、AKR1B10、ENAH 等基因在TCGA數(shù)據(jù)庫中，其高表達與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)（＜0.05）。通過Pubmed文獻檢索，發(fā)現(xiàn)ROBO1作為分泌蛋白Slit2的受體，通過Slit2-Robo1信號通路激活肝星狀細胞，從而促進肝損傷和纖維化。Song等在HCC組織和細胞中檢測Robo1的水平，發(fā)現(xiàn)Robo1被上調(diào)。Qin等發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白γ1（Lamc1）在肝細胞癌組織中上調(diào)，體外實驗推測Lamc1 可能通過PTEN/AKT途徑調(diào)節(jié)PKM2表達而參與HCC的進展。分泌型磷蛋白1（SPP1）參與編碼骨橋蛋白（OPN），OPN在肝纖維化和肝硬化等慢性肝臟疾病中起關(guān)鍵作用表達上調(diào)。Zhu等檢測170例HCC患者和120例健康體檢者血清醛酮還原酶1B10（AKR1B10）水平，發(fā)現(xiàn)HCC患者血清AKR1B10水平顯著高于健康對照組,聯(lián)合血清AFP檢測可提高肝癌的診斷率。AKR1B10被認為是一種新的HCC血清學生物標志物。

2.3 核心基因與臨床特征關(guān)系

購買堅果時，注意看看有無發(fā)霉長蟲，炒貨要看看有沒有燒煳，燒煳的堅果既產(chǎn)生了有害物質(zhì)，又使營養(yǎng)價值大打折扣。而且最好選擇原味的堅果。

2.4 ATP1B3和ENAH在臨床樣本中的驗證

同場PK：將葛蘭許和Bin 707放在一起PK是極其不公平的，這里不過是想比較一下兩款酒的風格而已，因為Bin707近年價位越來越逼近葛蘭許，是Penfolds眾多紅葡萄酒中最為強壯、飽滿的代表。707充滿力量，卻不會讓你覺得太霸道，濃郁的黑漿果香，入口復(fù)雜的香料香和更多層次的香氣。葛蘭許要深沉和沉穩(wěn)很多，它是一款你得要品嘗到第三口才能喝明白的年份，剛開始有很多你無法形容的感受。

收集來自廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院15對HCC及鄰近癌旁組織樣本，提取總RNA，接著對ATP1B3和ENAH在HCC組織及癌旁組織的表達進行了RT-qPCR實驗。可能由于樣本數(shù)較少，暫未發(fā)現(xiàn)這兩個基因與HCC臨床特征有顯著關(guān)系（表4）。RT-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)，ATP1B3和ENAH在HCC組織表達高于癌旁組織（＜0.05，圖5），可作為診斷HCC的良好指標。

3 討論

HCC是一種嚴重的全球健康負擔，其發(fā)生和發(fā)展的潛在機制很復(fù)雜，是全球癌癥相關(guān)死亡的常見原因。目前，盡管HCC在系統(tǒng)治療方面取得了進展，但由于診斷晚和頻繁潛在的肝臟疾病，患者的生存率仍然很低。尚不清楚不同形式的肝炎和肝損害是如何引發(fā)HCC的。因此，確定共同的致病基因?qū)υ缙贖CC的檢測和預(yù)防非常重要。隨著多組學技術(shù)的應(yīng)用，生物標志物已成為診斷、預(yù)后和治療的有力工具。盡管，許多與HCC不同發(fā)生階段相關(guān)的關(guān)鍵分子被篩選出來，成為HCC早期篩查和治療的靶點。但是，肝細胞癌發(fā)生過程中的共同基因的研究，尚未見報道。

對118個DEG在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集表達情況進行驗證。發(fā)現(xiàn)除9個無明顯差異外，95個DEG在HCC組織下調(diào)（＜0.05），14 個DEG 在HCC 組織上調(diào)（＜0.05，表2）。為了能篩選出與HCC進展相關(guān)并且能成為疾病惡化程度的預(yù)后指標，結(jié)合Pubmed文獻檢索，在上調(diào)基因中選擇ATP1B3和ENAH這2個研究很少的基因。接著對ATP1B3和ENAH分別做了在不同肝臟疾病類型數(shù)據(jù)集中的表達差異分析，發(fā)現(xiàn)ATP1B3在惡性疾病中表達較高，特別在癌前病變肝硬化時期表達更高（圖3A），ENAH隨著疾病進展加劇，其表達逐漸增高（圖3B）。

目前，ATP1B3和ENAH與HCC進程相關(guān)的研究非常少。ATP1B3編碼Na+/K+-ATPase的β亞基，Na+/K+-ATPase不僅參與正常的細胞活動，在致癌過程中也至關(guān)重要。Li等發(fā)現(xiàn)ATP1B3在胃癌組織中高表達，可通過PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)胃癌細胞的進展和預(yù)后。Zhang等通過綜合數(shù)據(jù)集多轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)ATP1B3在HCC中高表達，且與生存和免疫浸潤相關(guān)。體內(nèi)功能分析發(fā)現(xiàn)ATP1B3參與HCC的增殖、遷移和轉(zhuǎn)化。預(yù)測ATP1B3可作為HCC診斷和潛在治療靶點。ENAH是一種肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白，參與控制細胞運動和細胞-細胞黏附。ENAH在多種癌癥中包括食管癌、胃癌和乳腺癌中過表達，Deng等結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析和體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)ENAH可通過Notch 信號通路促進肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移。ENAH可逆轉(zhuǎn)miR-139-5P對肝癌細胞的抑制功能作用，誘導肝細胞癌的惡性進展。本研究通過收集各肝臟疾病相關(guān)數(shù)據(jù)集分析，發(fā)現(xiàn)ATP1B3和ENAH在正常組織、低纖維化、高纖維化、肝硬化、HCC組織中其表達量隨著疾病進展大體上調(diào)，但ATP1B3在肝硬化階段表達最高。

在之前的課程中，已經(jīng)學習了C、G、D、A調(diào)的五指音階，這些音階均由“秘密公式”“全音—全音—半音—全音”的結(jié)構(gòu)構(gòu)成，即為大調(diào)音階。在大調(diào)音階的基礎(chǔ)上，將五指音階中的三音降低半音，即成為小調(diào)音階，它的結(jié)構(gòu)為“全音—半音—全音—全音”。由此，學生便輕松地掌握了C、G、D、A大調(diào)及其同主音小調(diào)的五指音階。至此，移調(diào)訓練不僅可以在大調(diào)之間相互轉(zhuǎn)換，也可以在大調(diào)與小調(diào)之間進行，同時，也幫助學生建立大調(diào)與小調(diào)的調(diào)性聽覺及理論認知能力，使這一模式的學習更加清晰和直觀。

生存分析發(fā)現(xiàn)，ATP1B3和ENAH在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中，基因的高表達HCC患者生存率低，有不良預(yù)后。ROC曲線分析ATP1B3和ENAH在診斷正常或腫瘤結(jié)局檢驗效能方面，ENAH AUC高達0.933，ATP1B3為0.821，具有較高檢驗效能。接著我們分析了ATP1B3和ENAH與HCC患者各臨床參數(shù)之間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ATP1B3隨著T分期、病理Stage和Grade進展，其表達量逐漸增高。ENAH在晚期病理Grade中，其表達量更高。以上說明ATP1B3和ENAH密切參與肝細胞癌的進展過程，可作為肝細胞癌預(yù)后和診斷標記物。最后我們收集到15 對肝細胞癌和鄰近癌旁組織，對ATP1B3 和ENAH 做RT-qPCR 驗證。研究發(fā)現(xiàn)ATP1B3和ENAH mRNA在癌組織表達上調(diào)。

參照組:該組患者予以四聯(lián)療法,使用的藥物為蘭索拉唑,使用劑量為15mg,一天2次,阿莫西林,使用劑量為1000mg,一天2次,左氧氟沙星,使用劑量為200mg,一天2次,枸櫞酸鉍鉀,使用劑量為220mg,一天2次。

綜上所述，我們通過生物信息學方法挖掘出從肝纖維化、肝硬化到HCC疾病進程中，表達逐漸上調(diào)且與HCC 患者生存、預(yù)后、進展和診斷密切相關(guān)基因：ATP1B3和ENAH，并通過收集臨床樣本驗證了其在肝癌組織的高表達，可以為HCC診斷和預(yù)后提供新的靶點和治療方向。

社會認知兩大基本維度對中庸思維三因子分別的回歸分析顯示，能動性對三因變量均不具有顯著預(yù)測作用，而社群性的預(yù)測作用均為極顯著，其中，對多方思考的預(yù)測率為18%(F=27.66，p<0.001)；對整合性的預(yù)測率為6%(F=7.98，p<0.001)；對和諧性的預(yù)測率為13%(F=18.95，p<0.001)。