慢性傷口細(xì)菌生物膜管理的研究進(jìn)展

鐘果玉 譚惠儀 葉雪梅

慢性傷口也稱慢性難愈性創(chuàng)面,目前對(duì)于其定義未達(dá)成統(tǒng)一的共識(shí)，傷口愈合學(xué)會(huì)對(duì)其定義：各種內(nèi)在或外在因素影響下，無法通過正常、有序、及時(shí)的修復(fù)過程達(dá)到生理解剖和功能上的完整狀態(tài)的傷口，關(guān)于時(shí)間的分界為4周未愈合的傷口[1-2]。隨著社會(huì)人口老齡化，慢性傷口也呈老齡化趨勢(shì)且數(shù)目日益增長(zhǎng)，慢性傷口的遷延不愈不僅對(duì)患者的身心造成負(fù)面影響，還給社會(huì)帶來醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]，帶來慢性傷口中細(xì)菌生物膜普遍存在，是引起傷口延遲愈合的重要因素。因此認(rèn)識(shí)生物膜、掌握其臨床特征、實(shí)施針對(duì)性的傷口管理，對(duì)促進(jìn)慢性傷口愈合具有重大意義。

1 生物膜定義及概述

生物膜[3]被定義為微生物（細(xì)菌和真菌）構(gòu)成的復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的微生物群落，能合成并分泌一種胞外多糖蛋白復(fù)合物多聚物( EPS）使包裹的微生物相互粘連并聚集形成膜狀物質(zhì)，不可逆地附著于創(chuàng)面上。 Malone等[4]于2017年結(jié)合生物膜體內(nèi)外證據(jù)共性，將其簡(jiǎn)化定義為：對(duì)于治療和宿主防御具有耐受性的細(xì)菌集合。生物膜的形成機(jī)制復(fù)雜[5]，涉及到傷口表面、微生物和EPS之間復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的相互作用，使其對(duì)抗生素和宿主免疫反應(yīng)表現(xiàn)出顯著的耐受性，延長(zhǎng)了傷口愈合時(shí)間。

2 早期識(shí)別診斷細(xì)菌性生物膜

2.1 細(xì)菌生物膜臨床識(shí)別

2.1.1 宏觀識(shí)別 據(jù)大量的臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)的腐肉相鑒別，根據(jù)歐美壓瘡專家咨詢組制定的臨床實(shí)踐指南[3]中提出腐肉一般為黃色、黏稠、柔軟不透明的疏松或穩(wěn)定附著于傷口的物質(zhì)；創(chuàng)面上的生物膜多為有光澤、凝膠狀的物質(zhì)，除了外觀性狀的區(qū)別，國(guó)內(nèi)外研究[6-7]還總結(jié)了兩點(diǎn)差異：一方面腐肉與創(chuàng)面基底部組織緊密連接相較細(xì)菌生物膜，需銳器徹底清創(chuàng);另一方面腐肉對(duì)酶類或自溶性清創(chuàng)敷料較細(xì)菌生物膜敏感。但是憑借主觀的判斷缺乏客觀標(biāo)準(zhǔn)，可信度及準(zhǔn)確度不高。

2.1.2 微觀檢測(cè) 由于生物膜的結(jié)構(gòu)微小，難以用肉眼識(shí)別，臨床利用實(shí)驗(yàn)顯微技術(shù)對(duì)傷口采集標(biāo)本進(jìn)行分析。雖然傷口組織活檢被視為細(xì)菌培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)[3]，但是出于操作的侵入性及對(duì)人員的技術(shù)較高，實(shí)踐中并不常用。拭子培養(yǎng)最被提倡用于傷口的細(xì)菌培養(yǎng)，采用Levines拭子技術(shù)其細(xì)菌定性培養(yǎng)結(jié)果與組織活檢的結(jié)果基本一致[3]。除了傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式，目前也采用現(xiàn)代分子生物技術(shù)，該技術(shù)是指通過對(duì)微生物染色體染色并分析其中的DNA序列鑒定微生物種類，如：變性梯度凝膠電泳（DGGE）,肽核酸-熒光原位雜交,聚合酶鏈反應(yīng)等[8]。DGGE可分析出傷口微生物的數(shù)目,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)未檢測(cè)出的細(xì)菌。Steven等[9]成功通過DGGE證明了傷口及周圍皮膚部位微生物的多樣性。但是因微生物的基因異質(zhì)性，分子生物技術(shù)無法有效地切除微生物DNA條帶等局限性，分子生物技術(shù)僅僅檢測(cè)出部分微生物種類的結(jié)果。隨著生物信息學(xué)與計(jì)算機(jī)技術(shù)日新月異發(fā)展，這些技術(shù)將用于微生物的快速定性和定量分析，提高識(shí)別慢性傷口細(xì)菌生物膜感染的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，這是未來檢測(cè)細(xì)菌生物膜的新方向。但目前因操作的復(fù)雜性及高昂的費(fèi)用，難以在臨床應(yīng)用與推廣。

2.2 細(xì)菌生物膜的臨床診斷

2017年的國(guó)際共識(shí)[10]中提出，傷口出現(xiàn)以下5大特征，提示生物膜感染的可能性:創(chuàng)面延遲愈合；創(chuàng)面復(fù)發(fā)性感染；抗生素、抗菌劑使用無效；傷口大量滲液滲出；傷口有輕度慢性炎癥、紅腫、紅斑。另外Bianchi等[11]認(rèn)為,檢測(cè)細(xì)菌生物膜的金標(biāo)準(zhǔn)是肽核酸-熒光原位雜交、共聚焦激光掃描顯微鏡或電子掃描顯微鏡等可視化技術(shù)。 Haesler等[12]認(rèn)為，通過肉眼觀察，傷口表面的深層位置物質(zhì)，因?yàn)榈挽`敏度尚不認(rèn)為是生物膜的臨床指標(biāo)。Johani等[13-14]證實(shí)，細(xì)菌生物膜經(jīng)常存在于傷口的深部組織（平均50~70μm）表面且以厭氧菌為主，肉眼難以精確識(shí)別導(dǎo)致忽視對(duì)其處理干預(yù)，這也是慢性傷口延遲愈合或不愈合的重要因素。通常傷口出現(xiàn)生物膜感染特征之一時(shí)，建議在嚴(yán)格無菌操作條件下進(jìn)行組織活檢或細(xì)菌培養(yǎng)，接著結(jié)合激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，觀察包裹在細(xì)菌表面的胞外多糖物質(zhì)，這是診斷細(xì)菌生物膜存在的重要陽(yáng)性指征［9-10］。生物膜的臨床診斷工具是慢性傷口實(shí)施有效管理策略的最大障礙，但是目前未在細(xì)菌生物膜的臨床識(shí)別、診斷的金標(biāo)準(zhǔn)方面達(dá)成共識(shí)。

3 細(xì)菌生物膜的創(chuàng)面管理

3.1 基本傷口管理原則

慢性傷口生物膜的微生物多樣性，生物膜表型其耐藥性[15]是浮游細(xì)菌的10~1000倍，因此采用多種并行干預(yù)策略顯得尤為重要。根據(jù)一項(xiàng)全球調(diào)查[16]，在生物膜管理共識(shí)中提出，針對(duì)慢性傷口患者的整體護(hù)理和創(chuàng)面管理：在管理傷口生物膜感染時(shí)，常忽略患者抗感染能力下降的相關(guān)因素，應(yīng)關(guān)注組織血氧供應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)、血糖水平和水腫等整體情況；創(chuàng)面管理需考慮創(chuàng)面床的準(zhǔn)備情況，包括清創(chuàng)、創(chuàng)面清潔、創(chuàng)面抗菌藥物管理和創(chuàng)面濕性平衡。

3.2 傷口床的準(zhǔn)備

3.2.1 清創(chuàng)術(shù) 是一種由外科醫(yī)生或傷口?？谱o(hù)士操作，去除腐肉、失活和壞死組織、細(xì)菌生物膜等，以改善或促進(jìn)傷口愈合的護(hù)理技術(shù)[17]。常見的清創(chuàng)方法為機(jī)械清創(chuàng)、銳器/外科清創(chuàng)、自溶清創(chuàng)和酶清創(chuàng)。 機(jī)械清創(chuàng)指利用機(jī)械力去除慢性傷口壞死組織的清創(chuàng)方法，最常見包括濕到干的敷料，水療（渦流）和傷口灌洗（脈沖式灌洗）等[3,17]。但是目前缺乏研究[18-19]證實(shí)機(jī)械清創(chuàng)能去除生物膜，所以臨床應(yīng)用也逐漸減少。 Swanson等[16]提出在合理安全的情況下，外科和銳器清創(chuàng)是清除失活組織及生物膜的金標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)建議所有類型的傷口進(jìn)行劇烈的清創(chuàng)（外科/銳器清創(chuàng)），凝血功能障礙及動(dòng)脈性缺血性的傷口除外。清創(chuàng)將慢性傷口轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙约铀倨溆?，雖然不能徹底清除細(xì)菌生物膜，但相對(duì)超過24 h成熟的生物膜，在清創(chuàng)24 h內(nèi)未成熟的生物膜，對(duì)局部抗菌劑更加敏感[16]。自溶性清創(chuàng)[20]指利用封閉或半封閉敷料（類型包括透明膜、水凝膠或水膠體等），保持傷口濕潤(rùn)，讓自身傷口滲液產(chǎn)生的內(nèi)源性酶（如蛋白水解酶），去除傷口床的壞死組織。Miller等[21]以傷口凝膠為例，該凝膠通過活性降解EPS破壞生物膜基質(zhì)，分解定植的細(xì)菌，同時(shí)提供濕潤(rùn)的愈合環(huán)境來清除生物。自溶性清創(chuàng)患者一般無疼痛感，但是禁用于嚴(yán)重感染的傷口。在清除細(xì)菌生物膜的安全性、有效性方面，相比外科/銳器清創(chuàng)術(shù)，其他類型清創(chuàng)術(shù)缺乏高等級(jí)的證據(jù)支持，對(duì)此期待我國(guó)更多的學(xué)者開展相關(guān)量性研究，隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)。

3.2.2 創(chuàng)面的清潔 指從傷口表面清除未黏附的炎性污染物，是促進(jìn)傷口愈合、減少生物膜發(fā)展及成熟的必需過程。若僅僅清洗傷口表面，傷口無潛在的感染物，可以應(yīng)用清水或等滲生理鹽水，但是生理鹽水對(duì)清除生物膜無效[3,22]。PerciVal等[22]證實(shí)，以濃縮的泊洛沙姆為基礎(chǔ)的表面活性劑，通過降低傷口床和清潔液之間的表面張力、化學(xué)極性，以破壞微生物黏附、去除傷口污染物，在生物膜管理中起著重要作用。Bellingeri等[23]的回顧性分析中，表面活性劑沖洗液為實(shí)驗(yàn)組，相比對(duì)照組（林格液或生理鹽水），在下肢靜脈潰瘍愈合率的影響中，結(jié)果顯示，表面活性劑的愈合率高達(dá)97%。臨床應(yīng)用傷口清潔劑時(shí)，必須權(quán)衡其對(duì)細(xì)胞的潛在毒性，由于缺乏檢測(cè)傷口清潔劑的標(biāo)準(zhǔn)方法，及表面活性劑分解細(xì)菌生物膜EPS能力的證據(jù)，因此目前難以闡明傷口清洗劑的安全性。

3.2.3 負(fù)壓創(chuàng)面療法（NPWT） 通過充分引流傷口滲液改變創(chuàng)面pH,溫度和濕度等微環(huán)境，有效去除細(xì)菌生物膜和控制感染[24]。早期應(yīng)用NPWT可以預(yù)防生物膜形成，達(dá)到改善傷口的目的[25]。Topaz等[26]首次報(bào)道，NPWT結(jié)合局部氧療（TOT）簡(jiǎn)稱NPWTO2新方法，利用-120 ~-150 mmHg（－15.99~－16.67kPa）的負(fù)壓值，2~3 L/min氧流量輸入傷口，治療厭氧菌獲得成功。蔣琪霞等[24]在32例慢性傷口觀察組中應(yīng)用負(fù)壓創(chuàng)面療法(負(fù)壓值為-120 mmHg)與局部氧療（氧流量為3 L/min）的干預(yù)方式，3個(gè)月內(nèi)治愈率為87.5%，得出NPWTO2在傷口中應(yīng)用可以控制感染、清除生物膜、改善創(chuàng)面微環(huán)境，進(jìn)而縮短傷口愈合時(shí)間。但是有研究[26]提出,NPWT在慢性傷口的局部可形成低氧環(huán)境，容易繼發(fā)厭氧菌感染，影響傷口愈合。

3.2.4 創(chuàng)面敷料的使用 敷料的選擇應(yīng)基于標(biāo)準(zhǔn)的臨床參數(shù)而不是敷料的含銀量或釋放活性。①單一敷料：含銀敷料目前認(rèn)為具有廣譜抗微生物的作用；含銀離子（5~10 mg/L）敷料[27]24 h內(nèi)可以清除約90%的傷口生物膜，48 h內(nèi)可完全去除；其局限性為銀離子可能對(duì)宿主細(xì)胞具有嚴(yán)重的細(xì)胞毒性作用以及潛在的副作用，皮膚良性但永久性藍(lán)灰色變色[28]。一項(xiàng)體外試驗(yàn)[29]中應(yīng)用1%磺胺嘧啶銀4 h的人成纖維細(xì)胞存活率僅18%，該結(jié)果證明其對(duì)皮膚創(chuàng)面的毒性作用。②多元性敷料：NGAD(next-generation antimicrobial dressig) 一種新型抗菌敷料液體傷口敷料由抗菌劑與表面活性劑組成，Walker等[30]通過非隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中評(píng)估113名患者,其中74%的患者懷疑有生物膜，NGAD平均干預(yù)4周后,傷口改善率為94.7%（107例）。不足之處，目前還缺乏建立針對(duì)含銀及其他創(chuàng)面敷料安全性、有效性的體內(nèi)模型或研究證據(jù)。

3.3 局部抗菌藥物的管理

目前無證據(jù)支持治療傷口相關(guān)感染時(shí)使用全身抗生素能預(yù)防生物膜感染[31]。理想的抗菌劑應(yīng)具有廣譜性，迅速持久到達(dá)創(chuàng)面床，在滲出液中仍有效的活性，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性低，無全身吸收。工程蜂蜜是一種公認(rèn)的傷口護(hù)理劑，Oryan等[32]就蜂蜜對(duì)傷口愈合的治療作用進(jìn)行論述，結(jié)合25項(xiàng)臨床研究中對(duì)不同所有傷口類型（慢性傷口在內(nèi)）使用不同的蜂蜜，得出了醫(yī)用蜂蜜促進(jìn)傷口的愈合，減少了瘢痕的形成。其他抗菌劑：20%冰醋酸、卡地姆碘、膠原酶等。局部抗菌藥物的應(yīng)用減少慢性傷口感染的風(fēng)險(xiǎn)及細(xì)菌耐藥性[33]。當(dāng)傷口感染區(qū)域擴(kuò)散到傷口邊界涉及骨骼或深層組織及全身時(shí)才針對(duì)性選擇抗生素。目前還缺乏足夠的文獻(xiàn)和臨床研究數(shù)據(jù)支持抗菌藥物在生物膜中的作用及機(jī)制，未來醫(yī)務(wù)人員可就此方面進(jìn)行深入研究，將為日后生物膜的臨床治療帶來極大改觀。

4 細(xì)菌生物膜最新輔助療法

4.1 納米材料

近年來，大多數(shù)金屬基納米材料，不僅通過活性氧來滅活細(xì)菌，而且同時(shí)釋放具有抗菌活性的納米粒子，殺滅病原菌，如銀納米顆粒( AgNPs) 。AgNPs作為生物膜靶向劑穿透生物膜并對(duì)多種細(xì)菌的生物膜治療有效[34]， 不僅顯著抑制和殺死浮游細(xì)菌，還有效阻止生物膜的形成，破壞生物膜結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)[15]，低濃度的AgNPs暴露導(dǎo)致成熟生物膜生長(zhǎng)遲緩，高濃度(18ug/ml)AgNPs完全阻止生物膜的形成。Su等[28]在體外試驗(yàn)及動(dòng)物模型中，利用可生物降解納米纖維敷料，通過局部傳遞抗菌肽再結(jié)合清創(chuàng)治療，不僅有效清除慢性創(chuàng)面生物膜，還對(duì)組織無明顯的細(xì)胞毒性作用。隨著治療生物膜材料和納米技術(shù)的發(fā)展，使生物膜靶向工程成為可能，其中納米顆粒提供了具有研究前景的治療平臺(tái)，有望減少抗生素的使用和細(xì)菌的耐藥性。

4.2 間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞( MSCs)是一種存在于骨髓，脂肪組織等多部位可自我更新的多功能細(xì)胞，可以通過直接分泌抗菌肽或間接調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)來達(dá)到抗菌和抑制炎癥反應(yīng)作用。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[35]中利用MSCs療法與抗生素相結(jié)合的創(chuàng)面生物膜更有效,有望成為治療慢性傷口感染的有效工具。但是仍需要更多的體內(nèi)研究，直接測(cè)定其對(duì)傷口生物膜管理的影響。

4.3 其他輔助干預(yù)

噬菌體[36]是一種針對(duì)細(xì)菌的病毒，作為選擇特異性的抗菌劑，聯(lián)合蜂蜜或清創(chuàng)術(shù)在體內(nèi)外模型中的應(yīng)用均有效去除生物膜，未來臨床應(yīng)用中可能是一種有效的輔助手段。益生菌、抗生素光動(dòng)力學(xué)及無接觸低頻超聲波等新技術(shù)均為細(xì)菌生物膜的管理策略提供了新的方向。

5 展望

細(xì)菌生物膜在慢性傷口領(lǐng)域的研究日益引起人們廣泛關(guān)注，如何識(shí)別和診斷細(xì)菌生物膜，為慢性傷口患者提供有效的、創(chuàng)面管理成為關(guān)鍵，因此通過查閱相關(guān)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)總結(jié)：目前識(shí)別及清除細(xì)菌生物膜仍處于探索階段，染色法和現(xiàn)代顯微技術(shù)的發(fā)展使細(xì)菌生物膜的定位與識(shí)別成為可能；目前國(guó)際上管理細(xì)菌生物膜的趨勢(shì)是兩種及以上干預(yù)方式的聯(lián)合應(yīng)用（如清創(chuàng)+局部抗菌劑、清創(chuàng)+創(chuàng)面敷料等），促進(jìn)傷口愈合提高患者生存質(zhì)量。雖然新的抗細(xì)菌生物膜技術(shù)，在體外模型的應(yīng)用取得了進(jìn)展,但是其存在局限性：第一，許多用于慢性傷口管理的傷口治療決策，特別是細(xì)菌生物膜方面，缺乏大量強(qiáng)有力的證據(jù)支撐及臨床的隨機(jī)對(duì)照驗(yàn)證；第二，對(duì)生物膜的研究大多仍局限于體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，使用“未成熟生物膜”進(jìn)行干預(yù)，缺乏臨床評(píng)估及標(biāo)準(zhǔn)的傷口護(hù)理，得出的相關(guān)性研究結(jié)論令人質(zhì)疑；第三，通過對(duì)慢性傷口患者的整體評(píng)估與傷口局部評(píng)估有機(jī)結(jié)合，進(jìn)一步探索適用于慢性傷口患者，清除細(xì)菌生物膜的有效性、安全性、經(jīng)濟(jì)性的創(chuàng)面干預(yù)策略，未來可進(jìn)行大樣本的對(duì)照試驗(yàn)和多中心研究，為臨床工作者提供證據(jù)和推廣應(yīng)用，改善慢性傷口患者結(jié)局。