FAM20A條件性基因敲除小鼠牙齦增生的組織測量學(xué)分析

劉 靜，李麗麗，劉培紅，馬 肅

人類基因組測序完成后，基因命名委員會將具有相似序列的基因歸為一個家族(Family)，即Fam，依次編碼為Fam1， 2， 3……Fam20即序列相似家族中的第20個家族，在哺乳動物體內(nèi)，其成員包括Fam20A，F(xiàn)am20B，F(xiàn)am20C[1-2]。

臨床報道，人Fam20A基因突變會導(dǎo)致牙齦纖維增生綜合征(amelogenesis imperfecta gingival fibromatosis, AIGFS)與釉質(zhì)-腎臟綜合征(enamel renal syndrome，ERS)[3]。AIGFS患者通常會出現(xiàn)牙齦纖維性增生，釉質(zhì)發(fā)育不良，牙齒萌出障礙，牙髓內(nèi)鈣化等病理現(xiàn)象[4-5]；ERS患者除表現(xiàn)牙齦增生和釉質(zhì)發(fā)育不良外，還會出現(xiàn)腎鈣質(zhì)沉著或腎結(jié)石[6]。AIGFS和ERS患者均伴發(fā)明顯的牙齦增生，其發(fā)病機制尚待研究。

本實驗通過建立Fam20A條件性基因敲除小鼠動物模型，即選擇性地敲除小鼠上皮內(nèi)的FAM20A基因，并對其牙齦表型進(jìn)行形態(tài)學(xué)測量分析，為進(jìn)一步研究其機制提供組織學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ProFlex PCR儀(Life Technologies公司，美國)；OLYMPUS SZ51體視顯微鏡(OLYMPUS株式會社，日本)；Eppendorf單通道微量移液器1000/200/10/2(Eppendorf股份公司，德國)；LEICA Modell SM 2000R切片機(LEICA微系統(tǒng)股份公司，德國)；Nikon ECLIPSE 80i顯微鏡、Nikon NIS-Elements BR 3.0成像分析系統(tǒng)(Nikon株式會社，日本)；多聚甲醛(光復(fù)化工研究所，中國)；乙二胺四乙酸二鈉(西隴化工股份有限公司，中國)；蘇木素、伊紅、瓊脂糖(中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國)；EB 替代物(索萊寶科技有限公司，中國)；PCR-MIX 試劑盒(莊盟生物試劑有限公司，中國)。

1.2 實驗動物

1.2.1 報告基因標(biāo)記小鼠 Fam20Aflox/+小鼠建模于北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 工具鼠 k14-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠購買于蘇州南京醫(yī)科大學(xué)動物模式中心。

1.2.3 條件性基因敲除小鼠的繁殖 Fam20Aflox/+小鼠和Fam20Aflox/+小鼠交配，繁殖出Fam20Aflox/flox小鼠→Fam20Aflox/flox小鼠和k14-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，繁殖出k14-Cre；Fam20Aflox/+小鼠→k14-Cre；Fam20Aflox/+小鼠與Fam20Aflox/flox小鼠交配，繁殖出k14-Cre；Fam20Aflox/flox小鼠(小鼠上皮內(nèi)的Fam20A基因被敲除)。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)Fam20Aflox/flox小鼠或者失去Fam20A一個等位基因的小鼠(Fam20Aflox/+小鼠)沒有任何表型變化，同正常野生小鼠表型完全一致，所以本實驗以Fam20Aflox/+或者Fam20Aflox/flox小鼠作為正常對照小鼠。這樣不僅可以減少小鼠的需要量而且可以消除不同窩小鼠之間的潛在差異。

1.2.4 條件性基因敲除小鼠的鑒定 將出生后7 d小鼠剪取3～5 mm鼠尾→放入EP管中→做標(biāo)記→每個EP管中裝入裂解液500 μL→100 ℃煮沸10 min→冷卻至室溫→每管加10 μL蛋白酶K→震蕩器混勻→55 ℃恒溫消化過夜→震蕩器打散組織→100 ℃煮沸10 min→冷卻至室溫→15 000 r/min，離心20 min→取上清液1 μL作為模板進(jìn)行25 μL體系PCR→加熱(95 ℃10 min)→退火(60 ℃35個循環(huán))→延伸(72 ℃5 min)。

鑒定Fam20A基因中外顯子5～8被敲除后等位基因的引物：Primer-F:5′-gaaactttgcagtccttgttccc-3′，Primer-R:5′-gcactatcaatgccaagtttcc-3′。鑒定k14-Cre等位基因的引物：Cre-F:5′-atttgcctgcattaccggtc-3′，Cre-R:5′-atcaacgttttcttttcgg-3′。

1.2.5 實驗動物分組 k14-Cre;Fam20Aflox/flox條件性基因敲除小鼠及同窩正常小鼠各20只，共計40只，分別于出生4、6、8、12周處死取材，每組各5對。所有小鼠均飼養(yǎng)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院實驗動物中心，使用均經(jīng)過了哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物管理和使用委員會的批準(zhǔn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 將出生4、6、8及12周的Fam20A條件性基因敲除小鼠和正常對照小鼠，用1.5%戊巴比妥鈉(0.01 mL/g)腹腔注射麻醉，解剖暴露心臟，0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注內(nèi)固定；解剖獲得小鼠雙側(cè)下頜牙體-牙周組織標(biāo)本，選取小鼠的右側(cè)標(biāo)本塊保存于0.5%多聚甲醛中，在體視顯微鏡下觀察，拍照。

1.3.2 組織學(xué)測量 將上一步驟中獲得左側(cè)牙周-牙體組織塊置于4%多聚甲醛外固定24 h→去除牙齦組織以外多余軟組織→15%EDTA 4 ℃搖床脫鈣1～2周→下頜第一磨牙近中面為包埋面常規(guī)石蠟包埋→頰舌向連續(xù)切片→片厚4 μm→下頜第一磨牙近遠(yuǎn)中向中點處隨機選擇3張切片，行HE染色。

光鏡下觀察各組標(biāo)本頰側(cè)牙齦上皮和結(jié)締組織的組織學(xué)形態(tài)。采用Nikon IS-Elements BR3.0成像分析系統(tǒng)攝片，并在100倍視野下手動測量各組標(biāo)本頰側(cè)牙齦總面積、牙齦上皮面積、牙齦結(jié)締組織面積3個指標(biāo)，測量由同一人完成，每個標(biāo)本測3張切片，每張切片測3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件包對每一指標(biāo)進(jìn)行析因設(shè)計的方差分析和費舍爾最小顯著性差異確定顯著性水平，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Fam20A上皮基因敲除小鼠鑒定結(jié)果

利用Primer-F 和Primer-R 這對引物，如果只擴增出545 bp的條帶，則標(biāo)記為Fam20Aflox/flox(圖1中左側(cè)的1、2、4號樣本)；如果只擴增出435 bp條帶，則標(biāo)記為Fam20A+/+；如果既擴增出545 bp的條帶，又?jǐn)U增出435 bp條帶，則標(biāo)記為Fam20Aflox/+。同時利用Cre-F和Cre-R這對引物，可出現(xiàn)k14-Cre等位基因擴增出的350 bp條帶；或為Wildtype 等位基因不出現(xiàn)任何條帶(圖1)。綜合上述兩種引物，當(dāng)只產(chǎn)生545 bp 的Fam20Aflox/flox條帶，同時又能產(chǎn)生350 bp條帶，也就是k14-Cre； Fam20Aflox/flox小鼠，即我們所需要的Fam20A條件性基因敲除鼠，而Fam20Aflox/+小鼠即本實驗中的正常對照組小鼠。

圖1 K14-cre；Fam20Aflox/flox基因鑒定結(jié)果

2.2 牙齦形態(tài)學(xué)觀察

與對照組小鼠相比，F(xiàn)am20A條件性基因敲除小鼠的牙齦組織體積明顯增大，厚度明顯增厚(圖2)。

左圖為對照組小鼠牙齦組織體式顯微鏡下圖片；右圖為Fam20A條件性基因敲除小鼠牙齦組織體式顯微鏡下圖片；藍(lán)色虛線的長度分別代表下頜第一磨牙頰側(cè)中點處和齦乳頭處牙齦寬度；B：頰側(cè)；L：舌側(cè)；Ctrl：對照；cKO：條件性基因敲除

2.3 牙齦組織學(xué)染色觀察

與對照組小鼠相比，F(xiàn)am20A條件性基因敲除小鼠牙齦組織增厚，牙齦上皮和結(jié)締組織均增厚，增厚未見明顯部位特異性，分布于整個牙齦組織。牙齦上皮角化層增厚，基底層細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量明顯增加；固有層面積增大，成纖維細(xì)胞數(shù)量增加，膠原纖維束大量堆積，膠原纖維束明顯增粗，膠原束間隙明顯減小(圖3A)。各組均未觀察到明顯炎癥細(xì)胞浸潤及組織水腫情況(圖3A)。

2.4 牙齦組織組織學(xué)測量分析

基因敲除小鼠頰側(cè)牙齦增厚，頰側(cè)牙齦總面積、牙齦上皮面積和牙齦結(jié)締組織面積均大于對照組(P<0.05)。其中，4周齡基因敲除小鼠頰側(cè)牙齦總面積和牙齦上皮面積顯著大于對照組(P<0.01)，頰側(cè)結(jié)締組織面積大于對照組(P<0.05)；6周齡基因敲除小鼠頰側(cè)牙齦總面積、牙齦上皮面積和結(jié)締組織面積均顯著大于對照組(P<0.01)；12周齡基因敲除小鼠頰側(cè)牙齦總面積、牙齦上皮面積和結(jié)締組織面積均大于對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3B)。

3 討 論

人類基因組學(xué)研究證實，小基因Fam20家族中Fam20A 基因與Fam20C 基因在人類牙齒組織的發(fā)育中起重要作用，體外研究表明Fam20A和Fam20C 可形成功能復(fù)合體，一起行使對某些分泌蛋白的磷酸化功能[2]。

目前，病例報道可見Fam20A基因缺失導(dǎo)致的牙齦增生現(xiàn)象[7-8]，F(xiàn)am20C基因敲除鼠沒有出現(xiàn)牙齦上皮過度增生的表型變化[9-10]，也沒有學(xué)者報道人Fam20C基因突變導(dǎo)致雷恩綜合征的患者出現(xiàn)牙齦增生癥狀[10-14]。前期實驗中Fam20A基因條件性敲除鼠發(fā)生牙齦上皮細(xì)胞過度增殖的現(xiàn)象，而Fam20C基因敲除鼠未有牙齦變化[15]，這說明，在口腔組織中Fam20A可能不依賴于Fam20C，獨立行使其生物學(xué)作用。目前對Fam20A基因功能的研究還十分有限， Fam20A基因條件性敲除導(dǎo)致牙齦增生現(xiàn)象的具體分子機制需要闡明。

本實驗擬采用2016年Qin等同北京百奧賽圖動物模式有限公司合作制備的Fam20A條件性基因敲除小鼠，選擇性敲除口腔上皮內(nèi)的Fam20A基因[15]。通過帶有β-半乳糖苷酶的Fam20Aflox/flox小鼠和K14-cre 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，得到k14-Cre； Fam20Aflox/flox條件性基因敲除鼠(此小鼠上皮內(nèi)所表達(dá)的Fam20A 基因被敲除)。對該動物模型的牙齦表型進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究Fam20A基因突變導(dǎo)致牙齦改變的機制提供組織學(xué)基礎(chǔ)。

A：頰側(cè)牙齦組織HE染色( ×100)(標(biāo)尺50 μm)；B：頰側(cè)牙齦組織測量統(tǒng)計圖，從上到下依次為頰側(cè)牙齦總面積、牙齦上皮面積、牙齦結(jié)締組織面積

在對實驗動物的繁殖和飼養(yǎng)過程中，通過肉眼和體視顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)與對照組小鼠相比，所有基因敲除組小鼠頰側(cè)牙齦組織的體積均有增大，為了驗證該牙齦增生模型的可靠性，我們首先對小鼠進(jìn)行PCR基因鑒定，結(jié)果證實所有實驗組小鼠均為Fam20A條件性基因敲除小鼠，對照組為同窩正常小鼠。

小鼠出生后4周牙齒剛剛萌出，出生后8周性成熟，并且小鼠下頜第一磨牙的牙周牙體組織結(jié)構(gòu)與人牙最為接近[16]。基于此，本實驗以4、6、8和12周齡小鼠為研究對象，分別代表恒牙萌出小鼠，體成熟小鼠，性成熟小鼠和老齡小鼠，選取下頜第一磨牙為牙齦觀察部位。

通過組織學(xué)HE染色，觀察到基因敲除組小鼠頰側(cè)牙齦上皮細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量均增多，而且牙齦結(jié)締組織體積增大，纖維數(shù)量增多，密度增高。為了進(jìn)一步探討FAM20A條件性基因敲除小鼠牙齦上皮和牙齦結(jié)締組織的差異影響，使用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，分別測量4組小鼠下頜第一磨牙頰側(cè)牙齦總面積、牙齦上皮面積和牙齦結(jié)締組織面積，定量分析。結(jié)果顯示：在本實驗周期內(nèi)，實驗組小鼠頰側(cè)牙齦總面積、牙齦上皮面積和牙齦結(jié)締組織面積大于對照組(P<0.05)，這種差異隨小鼠周齡增長呈減弱趨勢，至8周后差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，所有小鼠牙齦組織內(nèi)均未見到炎性細(xì)胞浸潤和水腫現(xiàn)象。結(jié)果表明，在本實驗周期內(nèi)，F(xiàn)am20A基因缺失可誘導(dǎo)小鼠牙齦上皮和結(jié)締組織面積增加，而非牙齦炎癥導(dǎo)致。

本研究Fam20A基因只在上皮內(nèi)被敲除，結(jié)締組織內(nèi)的Fam20A基因并未被敲除；而實驗結(jié)果顯示，牙齦的增生是由上皮細(xì)胞和結(jié)締組織共同增多導(dǎo)致的，這一現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與發(fā)育過程中的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]有關(guān)，具體的分子機制尚有待我們進(jìn)一步研究揭示。