左、右半結(jié)腸癌在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、K-ras基因突變以及其他臨床病理特征方面的差異

陳朝旭 馬 歡 戰(zhàn)淑慧

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬青島市市立醫(yī)院東院消化內(nèi)科(266011)

背景：結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，左、右半結(jié)腸癌的發(fā)生機(jī)制、生物學(xué)行為、基因表達(dá)等方面存在明顯差異。目的：探討左、右半結(jié)腸癌在臨床病理特征、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、K-ras基因突變等方面的差異。方法：收集2017年6月—2018年6月青島市市立醫(yī)院收治的144例術(shù)后病理檢查確診為結(jié)腸癌患者的資料，采用免疫組化法評估MSI，PCR法檢測K-ras基因突變情況。分析左半結(jié)腸癌、右半結(jié)腸癌的臨床病理特征、MSI、K-ras基因突變等的差異。結(jié)果：右半結(jié)腸癌好發(fā)于女性，左半結(jié)腸癌好發(fā)于男性。右半結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA陽性率、MSI發(fā)生率明顯高于左半結(jié)腸癌(P<0.01)，而K-ras基因突變率顯著低于左半結(jié)腸癌(P<0.05)。左半結(jié)腸癌K-ras基因突變與患者性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CEA陽性率有關(guān)(P<0.05)；右半結(jié)腸癌MSI與患者性別、年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：左半結(jié)腸癌與右半結(jié)腸癌的MSI和K-ras基因突變存在不同程度的差異，可為結(jié)腸癌的診斷、個體化治療、預(yù)后提供依據(jù)。

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，目前其發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第三位，病死率位居第四位[1]。近年隨著我國經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，普通人群的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大變化，結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率均明顯上升。據(jù)2015年中國國家腫瘤登記中心(NCCR)的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第三位，病死率位居第五位[2]。以結(jié)腸脾曲為界，一般將結(jié)腸分為右半結(jié)腸和左半結(jié)腸，其中右半結(jié)腸包括回盲部、升結(jié)腸、橫結(jié)腸，左半結(jié)腸包括降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸，部分學(xué)者將直腸歸為左半結(jié)腸。由于左半結(jié)腸、右半結(jié)腸的胚胎起源和生物學(xué)行為的不同，目前已普遍接受左半結(jié)腸癌、右半結(jié)腸癌是兩種不同疾病的概念[3]。此外，左半結(jié)腸癌、右半結(jié)腸癌的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, MSI)、K-ras基因表達(dá)存等在不同，影響了腫瘤對化療藥物、靶向藥物的反應(yīng)性[4]，標(biāo)志著結(jié)腸癌進(jìn)入了個體化治療的新時代。本研究通過對左半結(jié)腸癌、右半結(jié)腸癌患者M(jìn)SI、K-ras基因突變以及臨床病理特征的差異進(jìn)行分析，旨在探討兩者的差異，從而為結(jié)直腸癌的個體化治療提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

一、資料來源

選取2017年6月—2018年6月青島市市立醫(yī)院收治的144例接受手術(shù)治療且術(shù)后病理檢查確診為結(jié)腸癌的患者，左、右半結(jié)腸癌各72例。所有患者均為初治，術(shù)前未接受過放、化療，且不合并其他部位腫瘤。本研究方案通過青島市市立醫(yī)院倫理委員會審批。

二、研究方法

1. MSI的檢測：采用免疫組化SP法檢測錯配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2表達(dá)，鼠單克隆抗體購于羅氏公司，免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實驗步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，組織以甲醛固定、石蠟包埋，再經(jīng)脫石蠟、抗原修復(fù)，分別加入抗MLH1(工作濃度1∶150)、抗MSH2(工作濃度1∶100)、抗MSH6(工作濃度1∶150)、抗PMS2(工作濃度1∶150)單抗，36 ℃孵育16 min，蘇木精復(fù)染4 min，靛藍(lán)試劑再次復(fù)染4 min。以正常細(xì)胞染色為對照，當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕色或褐色顆粒時判定為MLH1、MSH2、MSH6、PMS2陽性細(xì)胞(圖1)。當(dāng)四種蛋白均為陽性表達(dá)時則判定為微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)，四項中任一項為陰性則為MSI。

2. PCR-熒光探針法檢測K-ras基因突變情況：提取組織DNA(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit購自QIAGEN)，以分光光度計檢測DNA濃度，計算A260 nm/A280 nm比值，隨后行PCR擴(kuò)增(試劑盒購自北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司)。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火、延伸35 s，共45個循環(huán)。當(dāng)ΔCt值<8，判定為K-ras基因發(fā)生突變。

3. CEA的檢測：清晨取患者空腹血2～3 mL，離心，采用化學(xué)免疫分析法測定血清CEA水平，具體步驟按照羅氏公司試劑盒說明書操作。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料

72例右半結(jié)腸癌患者中，男性27例，女性45例，年齡31～88歲，平均67.2歲；72例左半結(jié)腸癌中，男性48例，女性24例，年齡44～84歲，平均64.3歲。

144例結(jié)腸癌患者中，65例(45.1%)CEA陽性，37例(25.7%)發(fā)生MSI，74例(51.4%)發(fā)生K-ras基因突變。

二、左、右半結(jié)腸癌的差異

左半結(jié)腸癌與右半結(jié)腸癌在性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA陽性率、MSI、K-ras基因突變等方面相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，即右半結(jié)腸癌好發(fā)于女性，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，CEA陽性率、MSI發(fā)生率更高，左半結(jié)腸癌K-ras基因突變率更高；而左半結(jié)腸癌、右半結(jié)腸癌患者的年齡、病理類型、浸潤深度、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤等方面相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

圖1 細(xì)胞核中出現(xiàn)褐色顆粒(免疫組化法，×400)

表1 左半結(jié)腸癌、右半結(jié)腸癌的臨床病理特征、MSI、K-ras基因突變情況比較 n(%)

三、左半結(jié)腸癌K-ras基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

在左半結(jié)腸癌中，K-ras基因突變與患者性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CEA陽性率有關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而與年齡、病理類型、浸潤深度、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤均無關(guān)(P>0.05)(表2)。

四、右半結(jié)腸癌MSI與臨床病理特征的關(guān)系

在右半結(jié)腸癌中，MSI與患者性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而與病理類型、浸潤深度、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤和CEA陽性率均無關(guān)(P>0.05)(表2)。

討 論

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是基因、環(huán)境等因素共同作用的結(jié)果，其中基因因素如癌基因、抑癌基因等突變在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起有至關(guān)重要的作用。目前，結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制仍未完全明確，RAS/RAF/MAPK、PI3K/AKT等由表皮生長因子受體(EGFR)介導(dǎo)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路持續(xù)激活導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的觀點已得到廣泛認(rèn)可[5]，其中K-ras基因突變被認(rèn)為是結(jié)直腸癌發(fā)生的早期標(biāo)志。K-ras基因是RAS家族的重要成員，亦是EGFR通路中最易突變的基因，在肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。K-ras基因可編碼具有GTP酶活性的RAS蛋白，當(dāng)K-ras基因發(fā)生突變時，RAS蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，GTP酶活性下降，使EGFR通路異?；罨?，細(xì)胞處于持續(xù)增殖狀態(tài)，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[6-8]。K-ras突變型已成為潛在的腫瘤標(biāo)志物以及精準(zhǔn)治療的靶點[9]。目前，EGFR藥物西妥昔單抗和帕尼單抗已用于結(jié)直腸癌的治療，但僅K-ras野生型患者才能從EGFR治療中獲益[9-10]。2015年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南亦建議，結(jié)直腸癌患者接受靶向治療前需行全RAS基因(包括K-ras、N-ras)檢測[11]。因此，K-ras基因檢測有望使結(jié)直腸癌患者的精準(zhǔn)治療成為可能。

除上述基因途徑外，MSI途徑亦是引發(fā)結(jié)直腸癌的重要機(jī)制，該途徑于1993年首次在遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC)中發(fā)現(xiàn)[12]。微衛(wèi)星是基因組中具有高度特異性的短串聯(lián)重復(fù)序列，當(dāng)錯配修復(fù)基因(MMR)發(fā)生突變或啟動子區(qū)甲基化時，引起MMR系統(tǒng)功能降低或喪失，使重復(fù)序列插入或缺失不能被糾正，導(dǎo)致微衛(wèi)星的長度發(fā)生改變，造成MSI，細(xì)胞失去正常調(diào)控功能，進(jìn)一步引起遺傳物質(zhì)的不穩(wěn)定性，或使癌基因、抑癌基因突變迅速積累，造成細(xì)胞增殖失控，從而引起腫瘤的發(fā)生。目前主要采用PCR和免疫組化法檢測MSI，這兩種檢測方法無明顯差異。有研究指出，對5個微衛(wèi)星位點(BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250)行PCR檢測，2個或以上位點出現(xiàn)不穩(wěn)定則定義為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-H)，1個位點不穩(wěn)定則定義為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-L)，無位點不穩(wěn)定則視為MSS[13]。有研究[14]發(fā)現(xiàn)，MSI-H的結(jié)直腸癌患者不能從氟尿嘧啶治療中獲益。NCCN指南亦指出，對Ⅱ期結(jié)腸癌患者給予氟尿嘧啶單藥化療前，需行MSI檢測。目前美國食品與藥品管理局(FDA)已批準(zhǔn)程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD-1)抑制劑用于治療MSI-H的晚期實體腫瘤患者，為MSI型結(jié)直腸癌患者帶來了治療的新曙光。

表2 左半結(jié)腸癌K-ras突變、右半結(jié)腸癌MSI與患者臨床病理特征的關(guān)系 n(%)

本研究對左半結(jié)腸癌、右半結(jié)腸癌患者的臨床病理特征、K-ras基因突變和MSI進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，右半結(jié)腸癌好發(fā)于女性，而左半結(jié)腸癌好發(fā)于男性。有研究認(rèn)為，右半結(jié)腸中膽汁酸代謝酶7α-羥化酶的濃度較高，雌性激素能促進(jìn)肝臟對膽固醇的代謝[15]，使膽固醇、膽汁酸及其代謝產(chǎn)物次級膽汁酸(主要為石膽酸和脫氧膽酸)進(jìn)入腸道，這些物質(zhì)尤其是次級膽汁酸具有很強(qiáng)的致癌作用，因此女性更易發(fā)生右半結(jié)腸癌。而男性的不良生活習(xí)慣如酗酒、吸煙、低纖維素飲食等可能是其左半結(jié)腸癌患病率高的原因[16-17]。從解剖部位來看，右半結(jié)腸血管、淋巴管較左半結(jié)腸更豐富，因此更易發(fā)生轉(zhuǎn)移，為右半結(jié)腸癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供了解剖學(xué)基礎(chǔ)。多項研究[18-20]證實，在病理類型方面，右半結(jié)腸癌以黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌多見，且分期晚，分化程度較低。但本研究未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，可能與印戒細(xì)胞癌、黏液腺癌的發(fā)病率較低有關(guān)，未來還需行多中心大樣本研究進(jìn)一步證實。本研究發(fā)現(xiàn)，右半結(jié)腸癌CEA陽性率高于左半結(jié)腸癌。有研究證實CEA與TNM分期具有相關(guān)性[21]，且右半結(jié)腸癌具有分期差、血管淋巴轉(zhuǎn)移率高等特點，導(dǎo)致右半結(jié)腸癌的CEA陽性率高于左半結(jié)腸癌。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者的K-ras基因突變率達(dá)51.4%，略高于以往的相關(guān)報道[22-23];且左半結(jié)腸癌K-ras基因突變率高于右半結(jié)腸癌(59.7%對43.1%，P<0.05)。從分子生物學(xué)水平看，染色體不穩(wěn)定性(CIN)是結(jié)腸癌發(fā)生的重要機(jī)制之一。有研究[24]發(fā)現(xiàn)左半結(jié)腸癌患者的染色體異常率明顯高于右半結(jié)腸癌；隨后，不同研究證實CIN常發(fā)生于左半結(jié)腸癌[25-26]。CIN可引起癌基因如K-ras突變以及抑癌基因APC、p53失活，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。但也有研究[27-28]認(rèn)為K-ras基因突變好發(fā)于近端結(jié)腸。目前K-ras基因突變與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系仍無明確定論。本研究結(jié)果顯示，左半結(jié)腸癌K-ras基因突變與性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA陽性率有關(guān)，而與年齡、病理類型、浸潤深度、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤無關(guān)。造成這種差異的原因可能與種族、樣本量、地域環(huán)境因素、檢測方法不一致等有關(guān)。此外，K-ras突變以點突變?yōu)橹?，其中?2、13密碼子突變最為常見[29]。有研究認(rèn)為K-ras突變與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)[30-31]，且12密碼子突變患者復(fù)發(fā)率高于其他位點突變[32]。本研究未能行進(jìn)一步分析。

本研究MSI的發(fā)生率為25.7%，且右半結(jié)腸癌的MSI發(fā)生率明顯高于左半結(jié)腸癌(P<0.05)，與以往研究[33-34]結(jié)果基本一致。進(jìn)一步說明左半結(jié)腸癌、右半結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制的不同，右半結(jié)腸癌可能由MSI觸發(fā)。目前對MSI與臨床病理特征的關(guān)系仍無確切定論。本研究發(fā)現(xiàn)，右半結(jié)腸癌的MSI與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

綜上所述，除臨床病理特征方面存在不同外， 左半結(jié)腸癌、右半結(jié)腸癌的MSI、K-ras基因突變等亦存在差異，進(jìn)一步闡明左半結(jié)腸癌、右半結(jié)腸癌為兩種不同的疾病，具有不同的生物學(xué)行為，為結(jié)腸癌的診斷、判斷預(yù)后和個體化治療提供了依據(jù)。