斑馬魚在藥物毒理學(xué)評(píng)估中應(yīng)用及機(jī)制的研究進(jìn)展

李紅燕，謝 倩，王 成，李金秀，馬 榮，任敉宏，李 勇，王佳俊，陳 海，王 建

斑馬魚在藥物毒理學(xué)評(píng)估中應(yīng)用及機(jī)制的研究進(jìn)展

李紅燕，謝 倩，王 成，李金秀，馬 榮，任敉宏，李 勇，王佳俊，陳 海，王 建*

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

與其他哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚具有繁殖能力強(qiáng)、繁殖量大、生命周期短、養(yǎng)殖費(fèi)用低、身體透明等特點(diǎn)。主要從心血管毒性、肝臟毒性、腎臟毒性、神經(jīng)毒性、脾臟毒性和急性毒性6個(gè)方面進(jìn)行歸納總結(jié)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑馬魚的多個(gè)器官在形態(tài)、基因表達(dá)及生理特性方面均與哺乳動(dòng)物高度相似，已被廣泛應(yīng)用于藥物的毒性物質(zhì)篩選研究。藥物對(duì)斑馬魚毒性研究主要集中在死亡率和畸形率增加，心、肝、腎、脾等臟器形態(tài)、表型改變并伴有水腫及神經(jīng)毒性等方面；其毒性機(jī)制主要涉及影響器官中細(xì)胞凋亡（p53通路）、炎癥（NF-κB通路、白介素）或影響該器官功能蛋白、酶或mRNA，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乙酰膽堿酯酶（AChE）、微球蛋白前體（）和α微管蛋白（α tubulin）等。斑馬魚模型可作為一種評(píng)估藥物安全性與毒性最為高效、快速、便捷的方法，闡明藥物的毒性作用及其多組分多靶點(diǎn)的毒性作用機(jī)制，可為藥物毒理學(xué)中的毒性評(píng)估提供新的思路。

斑馬魚；藥物毒理學(xué)；毒性評(píng)估；安全性評(píng)價(jià)；心血管毒性；肝臟毒性；腎臟毒性；神經(jīng)毒性；脾臟毒性；急性毒性

斑馬魚俗稱為斑馬擔(dān)尼魚、藍(lán)條魚、印度魚，是一種原產(chǎn)于印度和孟加拉國(guó)的輻鰭亞綱鯉科熱帶硬骨魚，身上有數(shù)條可直達(dá)尾鰭的深藍(lán)色條紋，因其全身?xiàng)l紋形似斑馬紋而得名。斑馬魚是僅次于小鼠的第2大模型生物，其具有體積小，樣本量大，胚胎透明易于觀察，與人類基因同源性高和實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)勢(shì)[1-3]，其胚胎、幼魚和成魚最早是被用來檢測(cè)水中的有毒物質(zhì)和致畸物[4]。后來也用于環(huán)境污染物的毒性評(píng)價(jià)，如原油、農(nóng)藥、重金屬、工廠污水和消毒副產(chǎn)物等對(duì)生態(tài)環(huán)境的毒性損害[5-7]。Streisinger等[8]于1981年首次將斑馬魚與遺傳學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域劃上聯(lián)系，使其研究領(lǐng)域得以拓展和延伸。目前，斑馬魚已被廣泛用于遺傳學(xué)、生態(tài)毒理學(xué)、藥物藥效活性物質(zhì)篩選、藥物代謝、藥物毒性物質(zhì)篩選等方面[9-11]。斑馬魚在藥物毒理學(xué)評(píng)估中的應(yīng)用匯總?cè)鐖D1所示。

提高藥物早期毒性預(yù)測(cè)的可靠性和靈敏度已成為新藥開發(fā)行業(yè)的迫切需求，而斑馬魚具有高通量的評(píng)價(jià)、檢測(cè)和篩選藥物毒性作用的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其作為藥物毒性與安全性評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受到醫(yī)藥學(xué)界越來越多的重視，已逐漸成為藥物研發(fā)過程中毒性評(píng)價(jià)和安全性評(píng)價(jià)的重要工具[12]。結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，本文綜述了斑馬魚作為新興模式生物在藥物毒理學(xué)評(píng)價(jià)方面的研究進(jìn)展，主要從藥物心血管毒性、肝臟毒性、腎臟毒性、神經(jīng)毒性、脾臟毒性和急性毒性6個(gè)方面及多組分多靶點(diǎn)的毒性作用機(jī)制進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為斑馬魚在藥物毒理學(xué)中的毒性評(píng)估提供新的思路。

圖1 斑馬魚在藥物毒理學(xué)評(píng)估中的應(yīng)用

1 評(píng)估藥物的心血管毒性

1.1 斑馬魚評(píng)價(jià)心血管毒性的優(yōu)勢(shì)

心血管毒性是藥物研發(fā)的主要限制因素[13]。斑馬魚的心血管系統(tǒng)是由心房、心室、靜脈竇和動(dòng)脈球串聯(lián)而成[14]，其心臟發(fā)育是一個(gè)迅速但復(fù)雜的過程，胚胎在受精后5 h（hours post fertilization，hpf）時(shí)心臟前體細(xì)胞成型，22 hpf時(shí)心臟開始出現(xiàn)收縮動(dòng)作，48 hpf時(shí)功能性瓣膜逐漸形成，心率趨于穩(wěn)定，72 hpf時(shí)完成胚胎期心臟的發(fā)育。與此同時(shí)，斑馬魚在24 hpf時(shí)尾部由蜷縮狀態(tài)開始伸展，節(jié)間血管開始生長(zhǎng)，到48 hpf時(shí)節(jié)間血管基本發(fā)育完全。有研究報(bào)道，斑馬魚心臟發(fā)育的形態(tài)、基因、生理特性以及血管生成過程均與哺乳動(dòng)物相似[15-16]，可通過光學(xué)顯微鏡對(duì)其心臟、血管和血液流動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行全程的監(jiān)視，用于探究藥物對(duì)斑馬魚的心血管毒性作用，為篩選藥物的心血管毒性作用提供有效依據(jù)[17]。目前，在血管系統(tǒng)、血液、內(nèi)皮細(xì)胞和心臟中表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因系斑馬魚的可用性也有助于精確和準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)藥物對(duì)心血管系統(tǒng)的影響[18]?？梢姲唏R魚的上述優(yōu)勢(shì)使其成為篩選藥物心血管毒性的重要生物模型。

1.2 藥物對(duì)心血管毒性的影響

傳統(tǒng)中藥中提取分離出的很多單體化合物具有明顯的藥理活性，可以作為新藥研發(fā)過程中的先導(dǎo)化合物，但是由于它們可能具有一些潛在的心血管毒性作用而限制了其臨床應(yīng)用。何俊霖等[19]以2、4、8、10 μg/mL異甘草素處理正常斑馬魚胚胎10、24 h，結(jié)果顯示異甘草素質(zhì)量濃度高于2 μg/mL可抑制斑馬魚胚胎血管生成，達(dá)8 μg/mL時(shí)，胚胎開始出現(xiàn)輕微血液瘀滯現(xiàn)象，且完全抑制尾部靜脈血管的生成。異甘草素處理12 h后，胚胎心率隨異甘草素質(zhì)量濃度的升高而呈降低的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10 μg/mL時(shí)，對(duì)胚胎心率有持續(xù)性的抑制作用和誘發(fā)心臟畸形的作用，導(dǎo)致胚胎心包和卵黃囊腫大。這表明高劑量的異甘草素對(duì)斑馬魚的胚胎發(fā)育有較強(qiáng)的毒性作用。趙慧等[20]建立阿霉素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因Tg（∶）系心臟特異表達(dá)綠色熒光斑馬魚心肌損傷模型，結(jié)果顯示阿霉素30、40 μg/mL干預(yù)24、48 h后，胚胎生存率顯著降低，其活動(dòng)受到抑制，心房、心室變大，出現(xiàn)不同程度的心包水腫，且動(dòng)脈球間距顯著增大；病理染色結(jié)果也提示給藥后斑馬魚心臟明顯變大，且結(jié)構(gòu)紊亂，有紅細(xì)胞溢出等。此外，氯化鋇、廣藿香、諾氟沙星、京大戟等對(duì)斑馬魚心血管發(fā)育生長(zhǎng)也具有一定影響[21-27]。斑馬魚在藥物心血管毒性中的研究見表1。

1.3 藥物對(duì)斑馬魚心血管毒性的作用機(jī)制

趙慧等[20]通過阿霉素建立心肌損傷模型，通過DAPI和TUNEL染色發(fā)現(xiàn)阿霉素40 μg/mL組斑馬魚心臟明顯變大，細(xì)胞數(shù)目減少且較稀疏，細(xì)胞核增大，凋亡細(xì)胞增多，且阿霉素對(duì)斑馬魚胚胎的心肌損傷作用呈時(shí)間和濃度相關(guān)性。表明阿霉素誘導(dǎo)的斑馬魚心肌損傷模型是可靠的，且其機(jī)制可能與增加心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。王冬梅等[24]觀察了0、10、20、40 μmol/L諾氟沙星對(duì)斑馬魚胚胎不同發(fā)育時(shí)期脊柱彎曲、心包囊腫、卵黃囊腫和死亡率等毒性作用，結(jié)果顯示隨著諾氟沙星暴露濃度的增大，胚胎的發(fā)育延遲，孵化時(shí)間延長(zhǎng)，胚胎死亡率增加；且暴露于不同濃度諾氟沙星的斑馬魚胚胎中基因表達(dá)隨發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)而增加趨勢(shì)減緩。提示諾氟沙星的心臟毒性機(jī)制與基因相關(guān)。

表1 斑馬魚在藥物心血管毒性研究中的應(yīng)用

TGF-β1-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 LD50-半數(shù)致死量

TGF-β1-transforming growth factor-β1 LD50-median lethal dose

2 評(píng)估藥物的肝臟毒性

2.1 斑馬魚評(píng)估肝臟毒性的優(yōu)勢(shì)

藥物性肝損傷已逐漸變成臨床醫(yī)學(xué)和新藥研發(fā)中的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。因此，尋找新的模型來預(yù)測(cè)潛在治療藥物是否導(dǎo)致藥物性肝損傷迫在眉睫。研究表明，斑馬魚肝臟在28 hpf時(shí)開始發(fā)芽，在72 hpf時(shí)被血液灌流并具有生理功能，在肝臟的形成過程中，其通體透明，易于觀察[28-30]。有研究顯示，斑馬魚的器官、生長(zhǎng)因子和基因的表達(dá)、肝細(xì)胞組成、功能、信號(hào)和對(duì)損傷的反應(yīng)等方面與高等脊椎動(dòng)物有很多相似之處[31-32]，使其成為檢測(cè)藥物肝毒性和研究其肝毒性機(jī)制的重要手段。將胚胎或幼魚暴露，通過觀察肝臟表型、特殊染色處理或生化指標(biāo)檢測(cè)等手段，可直接或間接探究藥物對(duì)斑馬魚肝臟的影響。此外，采用肝臟熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚，如Tg（∶）、Tg（∶）等作為模型，是評(píng)價(jià)肝臟毒性的又一手段，通過斑馬魚整體圖像的分析技術(shù)，對(duì)肝臟面積大小和肝臟熒光強(qiáng)度進(jìn)行綜合定量分析，快速、系統(tǒng)的評(píng)價(jià)藥物的肝臟毒性作用[33]。因此，斑馬魚作為藥物肝臟毒性篩選的模式生物，也具有重要的意義。

2.2 藥物對(duì)肝臟毒性的影響

段亞輝等[34]采用斑馬魚模型比較款冬花、葉的肝臟毒性，觀察款冬花和葉給藥后3 d對(duì)健康A(chǔ)B系及轉(zhuǎn)基因系斑馬魚肝、腎形態(tài)、肝臟的熒光面積、肝臟丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST），結(jié)果顯示款冬花和葉對(duì)斑馬魚肝臟生化指標(biāo)無顯著影響，但款冬花1.5 mg/mL組斑馬魚肝臟熒光面積減小，提示款冬花對(duì)肝臟產(chǎn)生一定的毒性，款冬葉未表現(xiàn)出明顯的肝毒性。全云云等[35]首次用肝臟熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（∶）對(duì)何首烏中的18種成分進(jìn)行了肝臟毒性研究，檢測(cè)斑馬魚肝臟表型、面積、熒光強(qiáng)度、肝體比和病理情況等指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，何首烏肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是由蒽醌類化合物介導(dǎo)，且以結(jié)合蒽醌為主，同時(shí)發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素和蘆薈大黃素-8--葡萄糖苷對(duì)斑馬魚體內(nèi)ALT、AST、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和總膽紅素（total bilirubin，TBIL）水平、肝臟組織病理等影響較大，可能是肝毒性主要物質(zhì)基礎(chǔ)[36]。此外，吡嗪酰胺、香加皮、芫花等對(duì)斑馬魚肝臟毒性作用，也取得了一定的成果[37-40]。見表2。

表2 斑馬魚在藥物肝臟毒性研究中的應(yīng)用

Caspase-3-半胱氨酸蛋白酶-3 Bax-Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白 Bcl-2-B細(xì)胞CLL/淋巴瘤2 SOD-超氧化物歧化酶 ROS-活性氧 CAT-過氧化氫酶 MDA-丙二醛

Caspase-3-cysteine protease 3 Bax-Bcl-2-associated X protein Bcl-2-B-cell CLL/lymphoma 2 SOD-superoxide dismutase ROS-reactive oxygen species CAT-catalase MDA-malondialdehyde

2.3 藥物對(duì)斑馬魚肝臟毒性的作用機(jī)制

付曉春等[37]考察雷公藤多苷對(duì)斑馬魚肝臟損傷的表型及對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示雷公藤多苷383、417 g/mL時(shí)給藥24～48 h顯著性增加斑馬魚的卵黃囊面積、增加肝臟面積和延遲卵黃囊的吸收。雷公藤多苷42.5、128、383 g/mL連續(xù)給藥48 h后可觀察到斑馬魚肝細(xì)胞凋亡明顯增加，Caspase-3蛋白活性增加，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量顯著增加，但Caspase-9蛋白的活性以及基因的表達(dá)未見明顯改變。提示雷公藤多苷的肝毒性機(jī)制與Caspase-3蛋白激活，促肝細(xì)胞過度凋亡有關(guān)。Quan等[41]用Tg（∶）型斑馬魚研究蘆薈大黃素的肝毒性作用及其潛在的毒性機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素的肝毒性機(jī)制與核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白的炎癥通路和基因的凋亡通路的激活有關(guān)。

3 評(píng)估藥物的腎臟毒性

3.1 斑馬魚評(píng)估腎臟毒性的優(yōu)勢(shì)

腎臟是人和高等動(dòng)物主要的排泄器官，主要濾過血液中的雜質(zhì)、維持體液和電解質(zhì)的平衡、藥物代謝等，因此腎臟容易成為藥物毒性物質(zhì)累積并引發(fā)急性損傷的靶器官。斑馬魚胚胎在24 hpf內(nèi)形成，具有由2個(gè)腎單位組成的解剖學(xué)上簡(jiǎn)單的腎上腺，其腎單位結(jié)構(gòu)、功能和分子組成與人類腎臟高度相似[42-43]，具有排泄水和維持滲透的功能[44]，故近年來在腎臟發(fā)育和腎臟疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)展有了巨大的增長(zhǎng)[45-46]。滲透壓調(diào)節(jié)紊亂易損傷斑馬魚腎臟，使其腎臟出現(xiàn)不同程度的水腫、組織形態(tài)改變等，可通過顯微觀察或組織病理切片觀察腎臟異常，還可通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚腎臟的熒光面積，評(píng)價(jià)腎臟損傷情況?？焖?、高通量篩選是斑馬魚作為腎臟毒性研究工具的重要優(yōu)勢(shì)。

3.2 藥物對(duì)腎臟毒性的影響

Hentschel等[47]利用腎毒性藥物第1次成功地構(gòu)建了斑馬魚急性腎損傷模型，在50、72 hpf的斑馬魚胚胎心臟靜脈竇內(nèi)注射慶大霉素或順鉑引起嚴(yán)重的腎小管重吸收功能障礙。梁錦鋒等[48]利用斑馬魚模型評(píng)價(jià)注射用鹽酸萬古霉素和厄貝沙坦片的腎毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)萬古霉素在注射劑量為16.4 ng/尾時(shí)，斑馬魚發(fā)育正常，未見明顯的毒性，注射劑量在54.7～273 ng/尾，有明顯的腎毒性。厄貝沙坦在8.3～91 μg/mL時(shí)，斑馬魚腎臟均發(fā)育正常，未見腎毒性。此外，也有關(guān)于中藥對(duì)斑馬魚腎毒性的相關(guān)研究。研究表明，款冬花和款冬葉中含有毒性物質(zhì)吡咯里西丁生物堿[49]。段亞輝等[34]通過款冬花和葉給藥后3 d對(duì)健康A(chǔ)B系及轉(zhuǎn)基因系斑馬魚的腎形態(tài)、表型和培養(yǎng)液蛋白量水平進(jìn)行觀察，評(píng)價(jià)藥物腎臟毒性，結(jié)果顯示各給藥組斑馬魚形態(tài)無明顯的改變，全身或局部未出現(xiàn)水腫，培養(yǎng)液上清中也無蛋白，提示斑馬魚腎小球?yàn)V過功能正常，藥物對(duì)斑馬魚腎臟無明顯毒性。說明斑馬魚可作為藥物腎毒性的篩選工具。

3.3 藥物對(duì)斑馬魚腎臟毒性的作用機(jī)制

Gorgulho等[50]采用10%慶大霉素、撲熱息痛和替諾福韋對(duì)斑馬魚幼魚腎臟的影響進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示慶大霉素和撲熱息痛降低腎清除率，撲熱息痛和替諾福韋擴(kuò)大近端小管，其腎毒性機(jī)制與線粒體改變有關(guān)，包括變形、線粒體腫脹、嵴斷裂和（或）基質(zhì)顆粒丟失。王雪等[51]采用Tg（∶）轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究馬兜鈴酸的腎毒性，發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸40～80 μmol/L處理后斑馬魚的腎出現(xiàn)腎小球囊性膨脹、結(jié)構(gòu)疏松、前腎管上皮細(xì)胞細(xì)胞排列松散、紊亂及管腔擴(kuò)張樣改變，qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)20 μmol/L馬兜鈴酸處理24 h后nephrin蛋白（nephrin表達(dá)于腎小球足細(xì)胞，其與裂孔隔膜的形成相關(guān)）表達(dá)顯著降低，表明馬兜鈴酸誘發(fā)腎損傷的原因可能是腎小球足細(xì)胞的功能變化。以上結(jié)果說明斑馬魚是研究藥物對(duì)于腎毒性作用的良好模型，并可以利用斑馬魚模型進(jìn)一步研究藥物腎毒性的相關(guān)研究。

4 評(píng)估藥物的神經(jīng)毒性

4.1 斑馬魚評(píng)估神經(jīng)毒性的優(yōu)勢(shì)

隨著人口老齡化，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生率也逐漸增加。近些年，研究人員發(fā)現(xiàn)斑馬魚作為模式生物進(jìn)行藥物神經(jīng)毒性研究評(píng)估較其他模型生物有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。斑馬魚的中樞神經(jīng)系統(tǒng)排列、神經(jīng)形成的過程和具體的機(jī)制以及對(duì)藥物的反應(yīng)與其他脊椎動(dòng)物相似，且很多神經(jīng)退行性疾病蛋白與人類同源[52]。盡管斑馬魚的神經(jīng)系統(tǒng)簡(jiǎn)單，但可以支配復(fù)雜的生理活動(dòng)，還能夠?qū)ζ溥M(jìn)行運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)和記憶等相關(guān)評(píng)價(jià)[53]。因此，斑馬魚作為脊椎動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用于篩選神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物和某些藥物神經(jīng)毒性的研究評(píng)估[54-55]。模式動(dòng)物斑馬魚的死亡率、孵化率、半數(shù)致死濃度（lethal concentration 50，LC50）、斑馬魚幼魚總移動(dòng)距離和平均速度是評(píng)價(jià)藥物神經(jīng)毒性的主要指標(biāo)。

4.2 藥物對(duì)神經(jīng)毒性的影響

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）被稱為“萬能溶劑”，在斑馬魚實(shí)驗(yàn)中廣泛被用來助溶某些實(shí)驗(yàn)試劑[56]，但目前關(guān)于DMSO在斑馬魚體內(nèi)的神經(jīng)毒性報(bào)道較少。甘津凡等[57]用0.5%、0.8%、2.5% DMSO對(duì)Tg（∶）斑馬魚胚胎及多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育的影響進(jìn)行了研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMSO會(huì)引起斑馬魚神經(jīng)毒性，造成間腦多巴胺能神經(jīng)元丟失及細(xì)胞增殖減少，導(dǎo)致胚胎發(fā)育障礙。尚楠等[58]將6 hpf的斑馬魚胚胎暴露于不同濃度氯丙嗪和丙戊酸鈉中，結(jié)果顯示氯丙嗪質(zhì)量濃度＞4.0 mg/L、丙戊酸鈉質(zhì)量濃度＞2.0 mg/L可引起斑馬魚胚胎出現(xiàn)濃度相關(guān)性死亡；氯丙嗪和丙戊酸鈉質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/L時(shí)可顯著降低斑馬魚幼魚總移動(dòng)距離和平均速度，且丙戊酸鈉毒性大于氯丙嗪。曹建斌等[59]觀察丙泊酚5、10、20 μg/mL對(duì)斑馬魚胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育的影響，結(jié)果顯示丙泊酚5 μg/mL組胚胎整體形態(tài)發(fā)育正常，但運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育受到抑制，丙泊酚10、20 μg/mL組胚胎發(fā)育停滯在原腸胚時(shí)期。提示丙泊酚暴露可抑制斑馬魚運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)育。劉靜等[60]研究牛黃鎮(zhèn)驚丸對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果顯示質(zhì)量濃度低于200 μg/mL時(shí)，未見胚胎發(fā)育異常。質(zhì)量濃度高于200 μg/mL時(shí)，胚胎頭眼發(fā)育較小，瞳孔無色；心臟畸形、心率較弱、血流受阻；尾干扭曲，卵黃囊延伸結(jié)構(gòu)變粗，脊索變細(xì)等。說明牛黃鎮(zhèn)驚丸質(zhì)量濃度大于200 μg/mL時(shí)對(duì)斑馬魚胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和骨骼等發(fā)育均有影響。

4.3 藥物對(duì)斑馬魚神經(jīng)毒性的作用機(jī)制

王翀昊等[61]以斑馬魚為動(dòng)物模型研究烏頭堿0.1、0.5、1、10、100 μmol/mL的神經(jīng)毒性并初步探索其神經(jīng)毒性的致病機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)烏頭堿濃度大于0.5 μmol/mL時(shí)可呈劑量相關(guān)性的顯著性降低斑馬魚游泳活力、幼魚的肌節(jié)長(zhǎng)度，抑制Rohon- Beard神經(jīng)元的生理性凋亡，推測(cè)其神經(jīng)毒性與抑制乙酰膽堿酯酶活性有關(guān)。但有研究認(rèn)為，藥物的神經(jīng)毒性機(jī)制與提高乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase，AChE）活力有關(guān)。朱璧然等[62]研究氯硝柳胺5、10、20、40、80 μg/L對(duì)斑馬魚幼魚的神經(jīng)毒性，結(jié)果顯示氯硝柳胺40、80 μg/L處理幼魚存活率降低、畸形率增加、運(yùn)動(dòng)速度降低，且幼魚微球蛋白前體（microglobulin precursor，）和α微球蛋白mRNA表達(dá)降低、AChE活力增加。顧杰等[63]采用幼魚染毒、運(yùn)動(dòng)行為學(xué)測(cè)試和胚胎整條原位雜交等實(shí)驗(yàn)以及熒光定量PCR手段，來研究雙酚AP（bisphenol AP，BPAP）和雙酚AF（bisphenol AF，BPAF）對(duì)斑馬魚早期神經(jīng)發(fā)育和行為的影響，發(fā)現(xiàn)BPAP和BPAF可擾亂斑馬魚運(yùn)動(dòng)軌跡，降低平均運(yùn)動(dòng)速度和移動(dòng)距離，使其出現(xiàn)呆滯現(xiàn)象，推測(cè)其神經(jīng)毒性機(jī)制與抑制斑馬魚神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因和突觸蛋白基因（synapsin ΙΙa，）的表達(dá)有關(guān)。王雪等[64]研究岡田酸0.05、0.10、0.20 μmol/L對(duì)斑馬魚幼魚神經(jīng)行為功能的影響，結(jié)果顯示0.05、0.10 μmol/L岡田酸處理后幼魚存活率、游動(dòng)軌跡無明顯差異。但0.20 μmol/L岡田酸處理后幼魚存活率、游動(dòng)活力、游動(dòng)距離明顯降低，呆滯時(shí)間明顯延長(zhǎng)，且幼魚體內(nèi)蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，）表達(dá)水平明顯下調(diào)，α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，）基因表達(dá)水平則無明顯改變。說明岡田酸的神經(jīng)毒性與基因相關(guān)。

5 評(píng)估藥物的脾臟毒性

脾臟是斑馬魚重要的免疫器官，主要起調(diào)控免疫作用，在對(duì)抗外來抗原方面至關(guān)重要。鄭美娜等[65]探索香澤蘭總黃酮對(duì)斑馬魚脾臟顯微組織結(jié)構(gòu)的毒性作用結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著香澤蘭總黃酮水觸媒染毒濃度的增加，斑馬魚脾臟顯微組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了不同程度的病變，主要表現(xiàn)含鐵血黃素沉著增多，脾竇擴(kuò)張，脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞增多，血細(xì)胞核濃縮、溶解，甚至導(dǎo)致脾臟壞死。說明模式生物斑馬魚是可以用來作為藥物脾臟毒性研究評(píng)估的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

6 評(píng)估藥物的急性毒性

6.1 斑馬魚評(píng)估藥物急性毒性的優(yōu)勢(shì)

安全性和有效性是藥物的兩大基本屬性，而我國(guó)傳統(tǒng)中藥，成分復(fù)雜、配伍多樣，為避免臨床使用中的不良反應(yīng)，對(duì)藥物進(jìn)行臨床前毒性評(píng)價(jià)和安全性評(píng)估顯得尤為重要。急性毒性實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)藥物安全性的主要指標(biāo)，對(duì)闡明藥物的毒性作用和探索其毒性靶器官具有重大意義[66]。與其他模型動(dòng)物相比，斑馬魚具有發(fā)育快、易獲取、易觀察、易檢測(cè)等顯著的優(yōu)勢(shì)，其胚胎也被廣泛應(yīng)用于藥物早期急性毒性研究評(píng)估。在斑馬魚急性毒性試驗(yàn)中，常選用LC50來表示該藥物的急性毒性大小。

6.2 藥物對(duì)急性毒性的影響

陳宏降等[67]研究魚腥草地上部分、魚腥草根莖、三白草地上部分、三白草根莖的95%乙醇提取物對(duì)斑馬魚成魚和胚胎的急性毒性，發(fā)現(xiàn)4種藥物的LD50分別為2.85、10.40、2.54、1.19 mg/L，且致畸主要表現(xiàn)為心包和卵黃囊水腫，提示這4種藥物的急性毒性主要體現(xiàn)在心臟。熊關(guān)慶等[68]研究了和厚樸酚0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L對(duì)斑馬魚的毒性損傷，發(fā)現(xiàn)和厚樸酚處理96、72、48、24 h后LC50分別為（0.530±0.014）、（0.679±0.013）、（0.758±0.012）、（0.816±0.01）mg/L，其安全濃度為（0.264±0.003）mg/L。和厚樸酚處理斑馬魚后雖未出現(xiàn)明顯的臨床病理變化，但組織病理學(xué)顯示斑馬魚的鰓和腦出現(xiàn)充血，還可見鰓呼吸上皮壞死，提示鰓和腦可能是和厚樸酚對(duì)斑馬魚的主要毒性靶器官。林青華等[69]通過比較檳榔不同炮制品對(duì)斑馬魚的LC50值及其生物堿、鞣質(zhì)類成分的含量，探討檳榔的毒性成分，發(fā)現(xiàn)生檳榔、炒檳榔和焦檳榔對(duì)斑馬魚幼魚的LC50值分別為29.74、32.47、40.03 μg/mL，水提物中總生物堿的含量依次為生檳榔＞炒檳榔＞焦檳榔，總鞣質(zhì)含量依次為炒檳榔＞生檳榔＞焦檳榔，提示炒檳榔、焦檳榔的急性毒性較生檳榔低，且生物堿類成分可能是其毒性成分。費(fèi)倩倩等[70]采用代謝組學(xué)的手段研究三七總皂苷給藥1 d后對(duì)Tuebingen品系斑馬魚胚胎急性毒性作用及可能機(jī)制，結(jié)果表明，隨著三七總皂苷給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，斑馬魚幼魚內(nèi)源性代謝物的改變?cè)郊用黠@，且呈現(xiàn)出時(shí)間相關(guān)性代謝軌跡，提示三七總皂苷給藥劑量越大，斑馬魚幼魚出現(xiàn)毒性癥狀的時(shí)間會(huì)大大縮短，且給藥時(shí)間越長(zhǎng)，體內(nèi)代謝更紊亂。揭示了三七總皂苷過量所出現(xiàn)的急性毒性可能與脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝以及能量代謝等代謝通路的紊亂有關(guān)。此外，1-萘酚、醋酸甲羥孕酮、姜黃素等對(duì)斑馬魚急性毒性研究也取得了一定的成果[70-76]。斑馬魚在藥物急性毒性中的研究見表3。

表3 斑馬魚在藥物急性毒性中的研究

TD50-半數(shù)中毒劑量 EC50-半數(shù)致畸濃度 IC50-半數(shù)抑制濃度 impdh1b-IMP(次黃苷單磷酸)脫氫酶1b impdh2-IMP(次黃苷單磷酸)脫氫酶2 IMPDH-IMP(次黃苷單磷酸)脫氫酶 TI-致畸指數(shù)

TD50-median toxic dose EC50-medianteratogenic concentration IC50-median inhibiting concentration impdh1b-IMP (inosine monophosphate) dehydrogenase 1b impdh2-IMP (inosine monophosphate) dehydrogenase 2 IMPDH-IMP (inosine monophosphate) dehydrogenase TI-Teratogenic Index

7 結(jié)語及展望

斑馬魚作為一個(gè)整體的模型生物，具有易于養(yǎng)殖、給藥量少、成本廉價(jià)、毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)多樣化等特點(diǎn)，其胚胎和幼魚可作為高通量藥物篩選的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停葟浹a(bǔ)了細(xì)胞模型的單一性，又彌補(bǔ)了嚙齒動(dòng)物模型的長(zhǎng)時(shí)間性，符合動(dòng)物福利的“3R”（減少、替代和優(yōu)化）理論，被廣泛應(yīng)用于藥物和環(huán)境污染物的毒性研究，特別是對(duì)我國(guó)具有分類龐雜、種類繁多和成分復(fù)雜的傳統(tǒng)單味中藥、復(fù)方和中成藥的毒性作用評(píng)估。此外，模式生物斑馬魚在藥物活性物質(zhì)篩選研究、疾病機(jī)制研究、藥物體內(nèi)代謝研究和藥物作用機(jī)制研究等方面也發(fā)揮著越來越重要的作用。

總結(jié)文獻(xiàn)資料顯示，藥物毒性研究主要集中于斑馬魚心血管、肝臟、腎臟、神經(jīng)、脾臟等方面，其主要表現(xiàn)為死亡率和畸形率增加、器官形態(tài)和表型改變、可能伴有水腫等發(fā)生等。部分研究從整體情況探討了藥物的器官毒性，少部分研究探索了藥物毒性機(jī)制，總結(jié)發(fā)現(xiàn)其主要影響細(xì)胞凋亡、炎癥以及特異性表達(dá)蛋白或酶等，影響斑馬魚胚胎或幼魚的發(fā)育從而產(chǎn)生一定的毒性。

目前斑馬魚在中藥毒性研究中的應(yīng)用還處于探索階段。在已有的很多文獻(xiàn)報(bào)道中，采用斑馬魚對(duì)中藥、中藥復(fù)方或中成藥進(jìn)行毒性及其機(jī)制研究時(shí)，大部分都只是針對(duì)中藥里面的全部成分或個(gè)別單體化合物進(jìn)行毒性檢測(cè)。而中藥或復(fù)方中包含成百上千種的化合物，各化合物之間可能通過多種途徑、多個(gè)靶點(diǎn)以及多個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)機(jī)體造成不可逆轉(zhuǎn)的毒性作用。同時(shí)，在中藥或復(fù)方的相關(guān)研究中，應(yīng)考慮斑馬魚模型是否具有代表性以及所測(cè)定的指標(biāo)是否具有針對(duì)性。如何更簡(jiǎn)單、更高效的利用模式生物斑馬魚明確某些中藥或復(fù)方中的毒性作用、作用靶點(diǎn)以及具體的毒性機(jī)制還需要更進(jìn)一步的拓展研究。通常情況下，器官毒性相關(guān)指標(biāo)的評(píng)價(jià)都在整體組織處理后獲得的，除神經(jīng)系統(tǒng)毒性研究有少量特異性指標(biāo)，其他器官毒性的特異性指標(biāo)有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，故在此后的研究中可考慮采用蛋白組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組等多組學(xué)技術(shù)研究分子信號(hào)通路探索藥物毒性作用靶點(diǎn)或機(jī)制。

盡管斑馬魚模型在評(píng)估藥物毒理學(xué)方面表現(xiàn)出獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)，但是由于與人類物種間的差異，斑馬魚模型也存在一定的局限性。（1）在解剖結(jié)構(gòu)上，斑馬魚血管直徑30～50 μm，且血液量少，在檢測(cè)血壓及采血方面難以實(shí)現(xiàn)；斑馬魚的呼吸系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物大不相同，且內(nèi)臟形成較哺乳動(dòng)物晚，一般發(fā)生于體節(jié)發(fā)育中期；與哺乳動(dòng)物由單一始基發(fā)育形成不同，斑馬魚的消化系統(tǒng)由不同始基形成，故目前對(duì)斑馬魚呼吸和消化系統(tǒng)的藥物篩選研究較為困難；（2）在基因?qū)用嫔希唏R魚基因雖與人類基因高度相似，但也存在差異，不少基因功能與人體差異明顯，為更好探究不同基因的作用，可采用斑馬魚配合其他動(dòng)物模型，特別是哺乳動(dòng)物（如小鼠等）模型進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。同時(shí)，斑馬魚實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，沒有統(tǒng)一的規(guī)格和質(zhì)控方法，故藥物研究結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性值得研究者思考。

此外，目前只有少量的文獻(xiàn)報(bào)道過關(guān)于斑馬魚胰腺、脂質(zhì)代謝和免疫系統(tǒng)方面的毒性作用，筆者猜測(cè)其可能的原因是這些器官和系統(tǒng)的代謝紊亂很難在光學(xué)顯微鏡下被觀察到[77]。然而，人類的這些器官和系統(tǒng)是常被懷疑為毒性物質(zhì)暴露的靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)可能與人類某些疾病的發(fā)生有密切聯(lián)系。因此，這些亟待解決的疑難問題依舊是今后科研人員重點(diǎn)研究的對(duì)象。

綜上所述，在眾多的模型動(dòng)物中，斑馬魚作為一種評(píng)估藥物安全性與毒性最為高效、快速、便捷的方法，可以闡明藥物具體的毒性作用及其多組分多靶點(diǎn)的毒性作用機(jī)制，目前已受到了醫(yī)藥學(xué)界和科研學(xué)界的廣泛關(guān)注。隨著人類社會(huì)科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，這一新興的模式生物在藥物毒性研究領(lǐng)域?qū)?huì)有更加廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)也為推動(dòng)中藥的研究與開發(fā)提供新的思路和新的平臺(tái)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research progress on application and mechanism of zebrafish in drug toxicology assessment

LI Hong-yan, XIE Qian, WANG Cheng, LI Jin-xiu, MA Rong, REN Mi-hong, LI Yong, WANG Jia-jun, CHEN Hai, WANG Jian

School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

Compared with other mammals, zebrafish have the characteristics of strong reproduction ability, large reproduction capacity, short life cycle, low breeding cost, and transparent body. The cardiovascular, liver, kidney, nerve, spleen and acute toxicity of zebrafish were reviewed in this paper. The results showed that multiple organs of zebrafish were highly similar to mammals in terms of morphology, gene expression and physiological characteristics, and they have been widely used in drug screening studies. Studies on drug toxicity to zebrafish mainly focus on: increased mortality and malformation rate, changes in the morphology and phenotype of the heart, liver, kidney, spleen and other organs, as well as whether it is accompanied by edema, neurotoxicity, etc.; The toxicity mechanism mainly involves affecting cell apoptosis in organs (p53 pathway), inflammation (NF-κB and interleukin), or proteins, enzymes or mRNA that affect the function of the organ, such as ALT, AST, AChE,, and α tubulin. It shows that the zebrafish model can be used as the most efficient, fast and convenient method for evaluating the safety and toxicity of drugs, elucidating the toxic effects of drugs and their multi-component and multi-target toxic mechanisms, which can provide new ideas for drug toxicology.

zebrafish; drug toxicology; toxicity assessment; safety evaluation; cardiovascular, liver toxicity; kidney toxicity; nerve toxicity; spleen toxicity; acute toxicity

R285.53

A

0253 - 2670(2021)01 - 0278 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.033

2020-09-16

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81873023）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81473371）

李紅燕（1995—），女，四川閬中人，碩士，研究方向?yàn)橹兴幉涣挤磻?yīng)與合理用藥。E-mail: 2390346837@qq.com

王 建（1959—），女，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)橹兴幉涣挤磻?yīng)與合理用藥。E-mail: jianwang08@163.com

[責(zé)任編輯 崔艷麗]