杉木不同世代育種群體的遺傳多樣性*

李 霞 王利寶 文亞峰 林 軍 武星彤 袁美靈 張 原 王敏求 李鑫玉

(1. 中南林業(yè)科技大學風景園林學院 長沙 410004； 2. 廣西國有東門林場 崇左 532108； 3. 中南林業(yè)科技大學林學院 長沙 410004； 4. 廣東省樂昌市龍山林場 樂昌 512200)

人工林是森林資源的組成部分，在木材生產、生態(tài)環(huán)境保護以及景觀建設中具有重要功能和作用(劉世榮等， 2018)。人工林可持續(xù)經營中，生物多樣性，特別是遺傳多樣性(genetic diversity)的保護和保持是一項非常重要的內容。對生命周期相對較長的林木來說，遺傳多樣性決定了它適應環(huán)境的能力，是維持森林生態(tài)系統(tǒng)長期穩(wěn)定的基礎，其對林木良種選育、營林措施的制定以及森林資源的保護、利用等具有重要意義(盛煒彤， 2018； Booyetal.， 2010； Loweetal.， 2004)。

人工林的遺傳多樣性受育種(造林)材料本身特性、資源分布、環(huán)境條件、人為干擾等因素的影響(Lefévre， 2004)，其中育種(造林)材料是最為關鍵的因素，它直接決定了人工林遺傳多樣性的高低，而其他因素是通過間接作用對人工林遺傳多樣性產生影響(文亞峰等， 2010)。隨著人工林可持續(xù)經營理念的提出和發(fā)展，遺傳多樣性水平作為一個重要指標越來越多地被用于評價林木種子質量(張澤寧等， 2008)。國內外林木良種選育基本上是沿著選優(yōu)、建園、子代測定、再選擇、再建園的輪回選擇路線，從低世代向高世代育種群體發(fā)展。育種材料的選擇及有效群體的確立不僅為林木遺傳改良和良種生產提供了重要途徑，而且能在保持人工林遺傳多樣性方面起到有效的積極作用。林木育種群體的遺傳多樣性在馬尾松(Pinusmassoniana)(朱必鳳等， 2007)、紅松(Pinuskoraiensis)(馮富娟等， 2007)、濕地松(Pinuselliottii)(易能君等， 2000)等樹種中有一定研究。馬尾松種子園的遺傳多樣性研究表明，表型選擇不會顯著降低育種群體的遺傳多樣性水平，有的甚至具有比親本或天然群體更高的遺傳多樣性(金國慶等， 2019； 賴煥林等， 1997)。相關研究進一步表明，在確立和管理林木育種群體過程中，選擇遺傳基礎較寬的、育種群體數(shù)量較大的、管理措施科學的育種材料有利于從源頭上保證和維持人工林群體的遺傳多樣性水平。

杉木(Cunninghamialanceolata)作為我國南方最重要的商品用材樹種，其遺傳改良走在其他樹種的前列，14個杉木分布省(區(qū))已開展了優(yōu)樹選擇、優(yōu)良基因收集、育種群體建立、子代測定等工作，積累了有關遺傳方差、配合力、交互作用和穩(wěn)定性分析等方面的大量數(shù)據(jù)(俞新妥， 2000； 2006)。目前，大部分杉木分布省(區(qū))的育種群體已從1代、1.5代發(fā)展到第2代，并且已獲得第3代育種群體(鄭仁華等， 2014)。雖然育種材料的遺傳變異引起了很大關注，但杉木育種群體的遺傳多樣性研究不足，特別是多世代育種群體間遺傳多樣性的動態(tài)變化研究更是缺乏?；诖?，本研究以我國2個國家級杉木良種基地的育種群體為研究對象，采用核基因組和葉綠體基因組微衛(wèi)星(SSR)標記技術，解析杉木不同世代育種群體的遺傳多樣性變化規(guī)律，檢測群體遺傳結構及其基因流，為我國杉木長期育種和人工林可持續(xù)高效經營提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇湖南攸縣杉木良種基地(YX，27°18′N，113°47′E)和廣東樂昌市龍山杉木良種基地(LC，25°12′N，113°28′E)的育種群體為研究材料。2個基地均屬于國家重點杉木良種基地，攸縣基地建于1976年，占地40 hm2，建有1代(F1)、1.5代(F1.5)和2代(F2)育種群體，初級建園材料以湖南、安徽、廣東、福建、湖北等地的杉木種源為主。樂昌市龍山基地建于1981年，占地45.5 hm2，建有1代、2代、2.5代(F2.5)和3代(F3)育種群體，初級建園材料以廣東、廣西、福建、貴州和湖南等地的杉木種源為主。

采樣方式以不同世代育種群體為單位，建園材料全部采集，每個無性系采1株。攸縣育種群體采集F1、F1.5和F2材料樣本183份，樂昌育種群體采集F1、F2、F2.5和F3材料樣本337份(表1)，7個育種群體根據(jù)來源地不同分為攸縣(YX)和樂昌(LC)2個組群。所有材料樣本采集新鮮幼嫩葉，硅膠干燥保存。杉木基因組DNA提取按Wen等(2013)的方法，利用紫外分光光度計檢測DNA質量。

表1 杉木育種群體材料的來源及數(shù)量Tab.1 The sources and sample number of Chinese fir breeding populations

1.2 微衛(wèi)星位點篩選與基因分型

1.2.1 核基因組SSR位點 從杉木(Wenetal.， 2013)和日本柳杉(Cryptomeriajaponica)(Uenoetal., 2012)已開發(fā)的EST-SSR位點中篩選獲得18個多態(tài)性較高的位點用于試驗分析(表2)。PCR反應體系和條件根據(jù)QIAGEN?多重PCR試劑盒的說明進行適當調整。多重PCR反應體系(10.0 μL) 中含2×Multiplex PCR master混合液5.0 μL，10×引物混合液1.0 μL，5～10 ng·μL-1的DNA模板1.0～2.0 μL(根據(jù)引物數(shù)量進行調整)。10×引物混合液由5～6個候選位點引物混合而成，其中含0.5～2.0 μmol·L-1的熒光標記通用引物(文亞峰等， 2015)、2.0 μmol·L-1正向引物(F)和2.0 μmol·L-1反向引物(R)。PCR反應程序為： 95 ℃預變性15 min； 94 ℃變性30 s，60 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)； 60 ℃延伸30 min。PCR擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增成功的多重PCR產物稀釋5～10倍后，在ABI3730自動測序儀上基因分型(Liz 600 為內標)，利用GENEMAPPER v. 3.7分析基因分型結果。

1.2.2 葉綠體基因組SSR位點 2個多態(tài)性位點CJCP1m_004 和 CJCP2m_002源于日本柳杉(文亞峰等， 2014)，正向引物5′端以FAM熒光標記后用于PCR擴增。PCR擴增體系和條件按 QIAGEN?多重PCR試劑盒方法并作適當調整。6.0 μL擴增體系中含1× PCR混合液3.0 μL、0.2 μmol·L-1正向和反向引物混合液1.0 μL、5～10 ng·μL-1的DNA 模板1.0～2.0 μL。PCR反應條件為： 95 ℃預變性15 min； 94 ℃變性 30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)； 60 ℃延伸30 min，利用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶。PCR片段基因分型在ABI3730自動測序儀上進行(Liz 600 為內標)，利用GENEMAPPER v. 3.7分析基因分型結果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 核基因組SSR數(shù)據(jù) 采用GENALEX 6.3(Peakall, 2006)統(tǒng)計各群體的等位基因數(shù)(Na)、私有等位基因數(shù)(Npa)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)。Fstat 2.9.3(Goudet, 1995)軟件估算各群體的等位基因豐富度(AR)、不同育種群體間的遺傳分化系數(shù)(Fst)、近交系數(shù)(Fis)。育種群體總體基因流(花粉和種子)根據(jù)公式Nm=(1/Fst- 1)/4計算獲得。利用STRUCTURE 2.3.3 (Pritchardetal.， 2000)進行群體遺傳結構分析，K值設定為1～7, 每個值運算10次，設置Burn in Period和MCMC (Markov Chain Monte Carlo)的迭代參數(shù)分別為50 000和100 000，將所得數(shù)據(jù)提交到STRUCTURE HARVESTER (Earletal.， 2012)，根據(jù)ΔK數(shù)值的分布確定最優(yōu)基因庫數(shù)K值。為使STRUCTURE圖示更為直觀，利用Clumpp軟件處理10次獨立運算數(shù)據(jù)，然后使用Distruct將計算結果圖形可視化輸出。Arlequin 3.0(Excoffieretal., 2005)對群組間、群體間和群體內的遺傳變異進行巢式分子方差分析(AMOVA)。

1.3.2 葉綠體基因組SSR數(shù)據(jù) 利用Haplotype Analysis1.05(Eliadesetal.， 2009)軟件進行單倍型分析，估算不同群體的單倍型數(shù)量(A)、有效單倍型數(shù)(Ne)、私有單倍型數(shù)(P)、單倍型豐富度(Rh)、遺傳多樣性指數(shù)(H)和群體分化系數(shù)(Fst)。種子介導的基因流根據(jù)公式Nm=(1/Fst- 1)/2計算獲得。

2 結果與分析

2.1 育種群體的遺傳多樣性與遺傳分化

EST-SSR標記結果表明，杉木育種群體的總體遺傳多樣性(Ht)為0.687，群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)為0.012，育種群體的近交系數(shù)(Fis) 為0.028(表2)。攸縣(YX)和樂昌(LC)組群都具有較高的遺傳多樣性，觀測雜合度(Ho)分別為0.671和0.656，期望雜合度(He)達到了0.678和0.667。以樂昌組群F2.5代的樣本數(shù)為最小參數(shù)(33)，2個組群的等位基因豐富度(AR)分別為7.715和7.293。攸縣和樂昌組群的遺傳分化系數(shù)(Fst)相同，都為0.008，組群內不同世代育種群體間沒有顯示出較大的遺傳分化。2個組群的近交系數(shù)分別為0.023和0.034(表3)。Fstat雙側檢驗結果表明，攸縣和樂昌組群的等位基因豐富度(AR)、觀測雜合度(Ho)和近交系數(shù)(Fis)均沒有顯著性差異(P>0.05)。

表2 18個EST-SSR位點的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of 18 EST-SSR loci

表3 杉木不同世代育種群體基于EST-SSR的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of different generations of breeding populations based on EST-SSR

2個cp-SSR位點分別檢測到2個和8個單倍型，2位點組合后共檢測到11個單倍型，攸縣(YX)和樂昌(LC)組群分別為8個和11個(表4)。杉木育種群體的總多樣性指數(shù)(Ht)為0.524，遺傳分化系數(shù)(Fst)為0.031。攸縣和樂昌組群的遺傳多樣性指數(shù)(H)分別為0.541和0.507，遺傳多樣性較為相近，但單倍型豐富度(Rh)存在較大差異，攸縣組群高于樂昌組群，分別為4.923和4.233。攸縣組群內群體間的遺傳分化高于樂昌組群，F(xiàn)st分別為0.017和0.014(表5)。

表4 杉木育種群體的單倍型信息Tab.4 Haplotype information in Chinese fir breeding populations

表5 杉木不同世代育種群體基于葉綠體SSR的遺傳多樣性參數(shù)Tab.5 Genetic diversity parameters of different generations of breeding populations based on cpSSR

2.2 育種群體的遺傳結構與基因流

核基因組微衛(wèi)星AMOVA分析結果顯示，遺傳變異主要存在于各世代群體內，群體內遺傳變異占總遺傳變異的98.57%，組群間和不同世代群體間的遺傳變異占總遺傳變異的0.62%和0.81%(表6)。STRUCTURE分析結果(圖1)顯示，當K=2時出現(xiàn)明顯的拐點且取得最大值，說明7個世代育種群體最有可能被分為2個基因庫(gene pool)(圖1A、B)。K=2時，攸縣組群大部分被劃分到基因庫1(綠色)中，樂昌組群在基因庫1和基因庫2(紅色)中各占一半，群體間或群體內都顯示出較高的雜合度； 2個組群低世代群體的相似性程度高，但高世代群體的基因庫存在較大差異(YX F2和LC F3)；K=3時，2個組群都有新的基因庫3(藍色)出現(xiàn)，但YX F2的基因庫組成變化更為明顯；K=4時，2個組群都有新的基因庫4(黃色)出現(xiàn)，總體組群類似于K=3時情況(圖1C)。2個組群單獨STRUCTURE分析結果(YX和LC)也顯示，攸縣和樂昌組群遺傳結構的差異主要出現(xiàn)在高世代育種群體。基因流檢測結果表明，2個組群的總體基因流相同，達到了31.0，而種子介導的基因流存在一定差異，攸縣和樂昌組群分別為28.9和35.2。

表6 杉木育種群體的分子方差分析(AMOVA)Tab.6 Analysis of molecular variance (AMOVA) of Chinese fir breeding populations

2.3 不同世代育種群體的遺傳多樣性

隨著育種進程的推進，攸縣組群和樂昌組群不同世代育種群體的遺傳變異有較為相似的變化規(guī)律。EST-nSSR分析結果顯示，隨著育種世代的升高，等位基因數(shù)(Na)、等位基因豐富度(AR)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)逐步降低，等位基因數(shù)(Na)的變化幅度更為明顯。從F1經F2和F2.5，再到F3，樂昌組群內各群體的期望雜合度降低比例分別為2.86%、1.91%和6.46%(圖2)。2個組群的私有等位基因數(shù)(Npa)有較大差異，攸縣組群檢測到7個私有等位基因，全部存在于高世代群體(F2)，而樂昌組群的14個私有等位基因都存在于低世代育種群體，F(xiàn)1和F2各有9個和5個私有等位基因(表3)。

葉綠體基因組SSR檢測結果也清晰顯示了遺傳多樣性隨育種進程的變化，從單倍型數(shù)(A)、單倍型豐富度(Rh)和群體多樣性指數(shù)(H)來看，攸縣和樂昌組群的變化趨勢略有差異。攸縣組群隨育種世代的升高，遺傳多樣性逐步上升，而樂昌組群則呈現(xiàn)先上升再降低的趨勢(表5)。

圖1 杉木7個世代育種群體STRUCTURE分析結果Fig.1 STRUCTURE analysis results of 7 generations of Chinese fir breeding populations

圖2 樂昌組群不同世代育種群體遺傳增益與遺傳多樣性變化的百分比比較Fig.2 Comparison of the percentage of genetic gain and genetic diversity of different generations in Lechang group

3 討論

3.1 杉木育種群體遺傳多樣性水平評價

本研究表明，我國杉木育種群體具有遺傳多樣性高、基因流大、近交率低的特點。杉木育種群體遺傳多樣性(nSSR)達到了0.687，其值不僅高于柳杉(Cryptomeriafortunei)(He=0.501)(徐進等， 2014)、馬尾松(He=0.482)(王鵬良， 2006)和華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)(He=0.502)(于大德等， 2014)種子園的遺傳多樣性，而且高于云南松(Pinusyunnanensis)(He=0.429)(許玉蘭等， 2015)和日本柳杉(Ht=0.651)(Kimuraetal.， 2014)等天然林群體的遺傳多樣性。攸縣和樂昌育種群體內的基因流達到了31.0，近交率低于0.028，基因流和近交率參數(shù)均優(yōu)于日本柳杉(Tsumuraetal.， 2014)。杉木長期育種過程中，不同世代育種群體的遺傳多樣性會隨著育種進程的推進而逐步降低，但世代間減少幅度小于6.46%，因此育種學家不必過分擔心杉木育種選擇過程中，其遺傳多樣性的損失，這與馬尾松(張薇， 2008)的研究結果有相似之處。

就葉綠體基因組標記而言，雖然本研究只選用了2個微衛(wèi)星標記位點，但其多態(tài)性非常豐富，11個單倍型清晰地反映了育種材料遺傳多樣性的變化規(guī)律： 隨著育種世代的升高，攸縣組群的遺傳多樣性逐步上升，而樂昌組群則出現(xiàn)先上升再降低的趨勢。葉綠體基因組的檢測結果與核基因組存在一定差異，這種差異既與不同基因組的遺傳方式(雙親或單親遺傳)有關，也與育種群體中材料的數(shù)量和來源有直接關系。杉木葉綠體基因組呈母性遺傳(Qietal.， 1999)，其標記結果反映了母本(種子)基因流的變化情況。本研究在采樣調查中發(fā)現(xiàn)，攸縣組群在育種過程中并未完全嚴格按照輪回選擇的方式，而是采取向高世代群體補充優(yōu)良育種材料(無性系)的措施，所補充的材料來源于12個湖南省優(yōu)良無性系(徐清乾等, 2002)。新的育種材料的補充一定程度提高了攸縣組群高世代育種群體的遺傳多樣性，使其F2育種群體出現(xiàn)較多私有等位基因(7個)和私有單倍型(3個)，也解釋了攸縣和樂昌高世代育種群體遺傳結構存在較大差異(圖1C，K=3)的原因。

3.2 杉木育種材料的科學管理

林木遺傳改良過程中，遺傳多樣性和遺傳增益的平衡一直是育種學家關注的重點(Krakowskietal.， 2003； 魏潤鵬， 1995； 王章榮， 2019)。根據(jù)本研究對樂昌不同世代育種群體遺傳增益的測定結果，隨著育種世代的增高，木材材積遺傳增益變化明顯，F(xiàn)1比對照林分增加16%，F(xiàn)2比F1增加21%，F(xiàn)3較F2增加10%(圖2)。本研究表明，在育種過程的不斷推進中，其育種群體的遺傳多樣性呈現(xiàn)逐步降低的趨勢，在杉木遺傳改良過程中，有效緩和遺傳增益和遺傳多樣性間的沖突是非常必要的，而為保證杉木長期育種目標的順利實現(xiàn)，育種材料資源體系的建立和科學管理顯得尤為重要(王章榮， 2012)。

林木長期育種過程中，育種群體的作用非常重要，既保證了遺傳增益的短期效益，又滿足了高世代育種的需求。從本研究對2個育種群體遺傳多樣性的檢測結果來看，我國杉木高世代育種策略和管理方法是科學有效的。在高世代育種過程中不斷補給新的育種材料是維持遺傳多樣性的有效措施，但應充分掌握補給材料的遺傳背景，避免產生近交等不利遺傳效應。今后還應進一步加強育種群體的組成結構、群體規(guī)模、選擇強度和方法等的研究，以保證近期和長期育種的遺傳增益(王章榮， 2012)。還可利用父本分析的方法，對杉木育種群體的花粉基因流、花粉污染情況進行定量監(jiān)測，以提高杉木良種質量。

分析育種材料的遺傳變異和多樣性水平，其目的在于獲得具有較高遺傳增益且遺傳多樣性豐富的生產群體。對于以生產良種為目的林木種子園，親本選配不僅要考察開花期、花果量、生長量、抗性、材性等多個性狀，同時還要考慮選配無性系的數(shù)量和親緣關系(Cotterill, 1984)，盡可能選擇不同種源的材料，以保證生產群體具有較高的遺傳多樣性水平。目前，杉木已建立了第2代、第3代種子園，但不少地方仍將育種群體和生產群體混為一體(王章榮， 2012)。杉木高世代育種過程中，應注意育種群體和生產群體的區(qū)分，組建獨立的育種群體，以保證長期的育種潛力和育種效率。

4 結論

湖南攸縣和廣東樂昌2個國家級杉木良種基地的育種群體有較高的遺傳多樣性水平，群體間具有基因流大、近交率低的特點。隨著育種進程的推進，高世代育種群體的遺傳多樣性有逐步降低的趨勢，但世代間遺傳多樣性的減少幅度小于6.46%，進一步說明我國杉木育種群體的管理和高世代育種策略是科學有效的。本研究結果可為我國杉木長期育種和人工林可持續(xù)高效經營提供科學依據(jù)。今后，還可對杉木育種群體的花粉基因流、外來花粉污染情況進行定量監(jiān)測，進一步提高杉木良種質量。