1種新型冠狀病毒核酸檢測試劑的性能驗證

張云麗，王鑫，邵玲，曲波，趙鴻梅(遼寧省人民醫(yī)院 中國醫(yī)科大學人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學科，沈陽 110016)

新型冠狀病毒(2019-nCoV)是β屬單股正鏈RNA病毒，巢病毒目，冠狀病毒科[1]，國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中指出新型冠狀病毒肺炎確診病例的診斷標準為有流行病學史和臨床表現的疑似病例同時具備病原學或血清學證據之一者。常用的病原學檢測證據即為實時熒光RT-PCR檢測2019-nCoV核酸陽性[2]。目前，大部分醫(yī)療機構建立了符合生物安全二級及以上標準的臨床實驗室均已相繼開展新型冠狀病毒核酸檢測項目。

根據中國合格評定國家認可委員會(China National Accreditation Service，CNAS)《醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則及其在分子診斷領域的應用說明(CNAS-CL02-A009)文件要求，臨床實驗室開展分子診斷檢驗項目前必須進行檢測系統的性能驗證，分子診斷領域中定性檢測項目驗證內容至少應包括測定下限、特異性、準確度、抗干擾能力等[3-4]。本研究按照CNAS-GL039《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》[5]，對中山大學達安公司生產的2019-nCoV核酸檢測試劑盒進行性能驗證，評價結果如下。

1 材料與方法

1.1樣本來源 2019-nCoV RNA液體性能驗證參考品(廣州邦德盛公司)。濃度為2.0×106copies/mL及2.0×105copies/mL的2019-nCoV RNA假病毒核酸標準物質編號分別為GBW(E)091133及GBW(E)091132。

1.2試劑和儀器 核酸提取試劑、2019-nCoV核酸檢測試劑(中山大學達安公司)；DA3200核酸提取儀(中山大學達安公司)，ABI 7500實時熒光PCR 儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.3方法 按照核酸提取試劑盒說明書進行核酸提取，實時熒光RT-PCR測定按照2019-nCoV核酸檢測試劑說明書操作，用ORF1ab基因和N基因作為檢測靶標基因。實驗條件：50 ℃ 15 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，40個循環(huán)。使用PCR擴增設備配套軟件(Real-Time PCR軟件v2.4)進行數據分析。根據擴增曲線，規(guī)定合適基線(一般起始設定為3，終止設定為15)和熒光閾值，得到不同通道循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)。陽性標準為FAM和VIC通道有明顯擴增曲線，且Ct≤40；陰性標準為FAM和VIC通道無擴增曲線或Ct值>40，且Cy5通道有擴增曲線；如僅在FAM或VIC單一通道Ct值≤40，另一條通道無擴增曲線，則結果需復檢，復檢結果一致可判為陽性，復檢均為陰性則為陰性。

1.4性能驗證方法及指標

1.4.1符合率 使用相同檢測方法的ISO15189認可實驗室作為參比實驗室，選取陰性樣本10例、陽性樣本10例。按照患者樣本檢測程序與參比實驗室進行比對，以參比實驗室結果為準，計算本實驗室與參比實驗室的總符合率、陽性符合率和陰性符合率[5]。

1.4.2檢出限 待驗證試劑盒說明書中聲明的檢出限為500 copies/mL。使用2019-nCoV RNA假病毒核酸標準物質與用于稀釋的不含有2019-nCoV RNA、無基質效應的核酸保養(yǎng)液共同制備的2019-nCoV RNA陽性樣本，濃度分別在2.0×106copies/mL、2.0×105copies/mL、2.0×104copies/mL、2.0×103copies/mL、5.0×102copies/mL、2.5×102copies/mL和1.25×102copies/mL 7個水平，在定性結果為陽性、濃度水平最低的標本所對應的濃度值即為該試劑的檢出限，該檢出限符合試劑說明書標準且每份樣本重復測定5次，100%檢出靶核酸，則檢出限驗證合格。

1.4.3交叉反應 驗證與檢測對象可能存在交叉反應的核酸物質對檢測的影響，主要指檢測對象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀的病原體核酸。本實驗使用的分析特異性參考品來自廣州邦德盛公司生產的標準物質。每份分析特異性參考品重復測定3次，結果都為陰性則交叉反應驗證合格。

1.4.4精密度 檢測濃度水平分別為2.0×103copies/mL和2.0×105copies/mL的精密度參考品，添加空白對照，每份樣本重復測定2次，連續(xù)測定5 d，計算各靶基因Ct值的變異系數(CV)，評價批間不精密度；同一份樣本重復測定10次，計算Ct值的CV，評價重復性(批內不精密度)。精密度符合說明書聲明范圍則驗證合格[6]。

1.4.5抗干擾能力 檢測含有內源性干擾物質血紅蛋白30 g/dL和清蛋白6 g/dL、外源性干擾物質利巴韋林+阿奇霉素100 μg/mL的濃度為2.0×103copies/mL的弱陽性樣本，樣本來源于廣州邦德盛公司生產的標準物質，與常規(guī)樣本一樣處理，重復測定3次，檢測結果為弱陽性，則抗干擾能力驗證合格。

2 結果

2.1符合率 本試劑檢測結果與參比實驗室檢測結果進行比對，發(fā)現10例陽性標本(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10)ORF1ab基因和N基因Ct值均<37，10例陰性標本(P11、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19、P20)均未檢出Ct值，總符合率、陽性符合率和陰性符合率均為100%，符合率驗證合格。

2.2檢出限 在檢測下限驗證中，本試劑盒對2.0×106copies/mL、2.0×105copies/mL、2.0×104copies/mL、2.0×103copies/mL、5.0×102copies/mL、2.5×102copies/mL和1.25×102copies/mL 7種濃度的2019-nCoV RNA陽性樣本的檢出率均為100%，見圖1。結果符合試劑說明書聲明標準，檢出限驗證合格。

注：A，單個樣本的檢出限驗證；B，所有樣本的檢出限驗證。從左至右分別為：L1，2.0×106 copies/mL；L2，2.0×105 copies/mL；L3，2.0×104 copies/mL；L4，2.0×103 copies/mL；L5，5.0×102 copies/mL；L6，2.5×102 copies/mL；L7，1.25×102 copies/mL。

2.3交叉反應 交叉反應驗證中，檢測含有人冠狀病毒HCoV-OC43 RNA假病毒、人冠狀病毒HCoV-HKU1 RNA假病毒、人冠狀病毒HCoV-229E RNA假病毒、人冠狀病毒HCoV-NL63 RNA假病毒、SARS冠狀病毒RNA假病毒、中東呼吸綜合征(MERS)冠狀病毒RNA假病毒、甲型流感病毒RNA陽性、乙型流感病毒RNA陽性、呼吸道合胞病毒A+B型陽性、人副流感病毒陽性、腺病毒陽性、腸道病毒陽性、肺炎支原體陽性、EB病毒陽性、人巨細胞病毒陽性、結核分枝桿菌陽性的2019-nCoV陰性樣本，重復3次的N基因及ORF1ab基因檢測結果均為未檢出。

2.4精密度 重復性驗證中，2.0×103copies/mL濃度水平的N基因CV為0.70%，ORF1ab基因CV為0.48%;2.0×105copies/mL濃度水平的N基因CV為1.36%，ORF1ab基因CV為0.52%。批間不精密度驗證中，2.0×103copies/mL濃度水平的N基因CV為1.17%，ORF1ab基因CV為1.36%；2.0×105copies/mL濃度水平的N基因CV為1.72%，ORF1ab基因CV為2.39%。CV符合試劑說明書要求標準(<5%)，精密度驗證合格。

2.5抗干擾能力 加入內源性干擾物質、外源性干擾物質的濃度為2.0×103copies/mL的弱陽性樣本重復測定3次的檢測結果均為陽性，抗干擾能力驗證合格。

3 討論

2019-nCoV核酸檢測作為新型冠狀病毒肺炎的確診手段，在快速診斷、療效評估、疫情防控中發(fā)揮重要作用[7]。疫情突發(fā)初期，很多核酸檢測試劑一經研發(fā)出來就投入臨床，沒有進行足夠的性能驗證，可能導致的假陰性結果使得核酸檢測在新型冠狀病毒肺炎診治中的意義被臨床醫(yī)生所質疑[7]。而性能驗證是保證檢測結果穩(wěn)定可靠的重要基礎，是臨床應用的前提，對檢測標準化和質量控制有重要的意義[8]。

本研究所驗證的核酸檢測試劑基于一步法實時熒光RT-PCR技術，選取2019-nCoV ORF1ab和N基因作為擴增靶區(qū)域，設計特異性引物及熒光探針(N基因探針采用FAM標記，ORF1ab探針采用Yellow標記)用于標本中2019-nCoV RNA的檢測，同時包括內源性內標檢測系統(內標基因探針采用Cy5標記)，用于對標本采集、核酸提取過程及PCR擴增過程的監(jiān)控。與兩步法相比，一步法檢測技術不僅可縮短檢測時間,更可減少實驗過程中樣品交叉污染的可能性,尤其適合大批量樣本操作[9]。使用的性能驗證參考品是以新型冠狀病毒假病毒培養(yǎng)液為原料，包含新型冠狀病毒重要特征基因核殼蛋白N基因(全長)、包膜蛋白E基因(全長)和ORF1ab(1)(全長)，用稀釋液稀釋制備成所需系列性能評價參考品盤，具有均勻、穩(wěn)定、與臨床樣本具有良好的互通性的特點。

在符合率評價中，本實驗室與另外一家通過ISO15189認可實驗室的符合率為100%。在交叉反應的評價中，結果顯示該試劑盒檢測結果與2019-nCoV種屬相近或引起癥狀相似的其他病原體(人冠狀病毒HCoV-OC43、人冠狀病毒HCoV-HKU1、人冠狀病毒HCoV-229E、人冠狀病毒HCoV-NL63、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腺病毒、腸道病毒、肺炎支原體、EB病毒、人巨細胞病毒、結核分枝桿菌)以及人基因組DNA無交叉反應。在精密度評價中，不同濃度水平的N基因重復性為0.70%及1.36%，批間不精密度為1.17%及1.72%；ORF1ab基因重復性為0.48%及0.52%，批間不精密度為1.36%及2.39%，符合說明書要求標準(<5%)。在抗干擾能力評價中，樣本中內源性干擾物血紅蛋白及清蛋白、外源性干擾物利巴韋林及阿奇霉素對試劑盒的檢測結果無干擾。在檢出限評價中，結果顯示該試劑盒檢出限為125 copies/mL，雖達到廠商聲明的標準，但是仍不足以達到理想的檢出限，如果臨床醫(yī)護人員在采樣過程中未采集到足量的病毒或感染初期人口咽部病毒含量低時，都可能會導致結果假陰性[10]。在與臨床的溝通中，建議為多次復查核酸結果陰性卻有明顯臨床癥狀的患者采集深咳痰液或肺泡灌洗液來提高陽性檢出率[11]，因此，后續(xù)試劑盒優(yōu)化的重點應是如何在不降低特異性的情況下不斷提高檢出限。