p16/ki-67雙重染色在宮頸癌篩查中的應(yīng)用分析

葉靜，王炯，劉曉清，卜相冉

(1. 長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院，山西 長(zhǎng)治 046000；2.山西省長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院婦科，山西 長(zhǎng)治 046000)

1 宮頸癌病變機(jī)制

宮頸癌作為我國(guó)女性常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，研究證明，高危型HPV持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌的主要病因，其可能發(fā)生的機(jī)制為：高危型HPV在持續(xù)感染宮頸上皮細(xì)胞的過程中, 將病毒DNA通過非同源重組的方式整合到宿主細(xì)胞基因組,大量轉(zhuǎn)錄兩個(gè)主要致癌基因E6、E7的mRNA,導(dǎo)致HPV E6/E7癌蛋白高表達(dá)，兩種蛋白以協(xié)作的方式引起上皮細(xì)胞永生化，而這是腫瘤惡變的前提。深入研究發(fā)現(xiàn)[1]，E6和E7蛋白轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力在一定程度上與另外兩種細(xì)胞內(nèi)蛋白P53蛋白和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,Rb)相互作用有關(guān)；相關(guān)具體機(jī)制將在下文詳細(xì)闡述。

2 p16/ki67雙重染色用于宮頸癌篩查或診斷的原理

2.1 p16基因分析

2.1.1 p16基因特點(diǎn)

l994年Kamb[2]等人首次提出并報(bào)道了pl6基因，該基因是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(Cyclin dependent kinase inhibitorCKIS)家族成員，定位于人第9號(hào)染色體短臂2區(qū)l帶(9p2l)，可編碼多種蛋白，其中p16INK4a蛋白作為其編碼產(chǎn)物之一，主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生作用，包括直接參與細(xì)胞周期的核心調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞分裂停止，終止細(xì)胞生長(zhǎng)，另一方面，進(jìn)一步誘導(dǎo)生長(zhǎng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抑癌基因的作用。在人體內(nèi)，p16基因的作用主要為以下幾個(gè)方面：①在細(xì)胞周期中，p16負(fù)調(diào)控pRb-E2F通路；②p16基因產(chǎn)物p16INK4a蛋白可與細(xì)胞周期蛋白D(Cyclin D)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞周期依賴性激酶(Cell cycle dependent kinase：CDK)CDK4/6，干擾CDK4/6與細(xì)胞周期蛋白D的結(jié)合，阻止細(xì)胞從G1期發(fā)展至S期，抑制細(xì)胞增殖，防止惡性變；③與JUNK1/3相互作用，抑制其激酶活性；④隨著細(xì)胞衰老p16相關(guān)蛋白會(huì)異常增加，高水平的p16相關(guān)蛋白會(huì)誘導(dǎo)干細(xì)胞及癌前腫瘤細(xì)胞衰老。

2.1.2 p16基因與腫瘤關(guān)聯(lián)性在人體內(nèi)，多種因子參與抑癌基因

和癌基因相互作用，保證機(jī)體內(nèi)部處于相對(duì)平衡狀態(tài)。p16基因是人們發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)直接作用于細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞分裂的基因，作為一種抑癌基因與許多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均有關(guān)系，所以也稱為多重腫瘤抑制基因。正常細(xì)胞內(nèi)存在p16-CyclinD-pRb通路，該通路可維持正常細(xì)胞周期進(jìn)行，其中，CyclinDl與CDK4、CDK6形成的復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的Rb磷酸化，使與Rb結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor)E2F釋放，E2F可使細(xì)胞周期繼續(xù)進(jìn)行，當(dāng)細(xì)胞受損或 DNA異常時(shí)，pl6與CyclinD競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDK4，從而抑制Rb磷酸化修飾，使轉(zhuǎn)錄因子E2F無法解離出來而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，阻止不正常細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，最終抑制細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化；當(dāng)pl6發(fā)生基因缺失、突變或甲基化等機(jī)制導(dǎo)致通路下調(diào)使pRb失活而不能正常表達(dá)時(shí)，突變的Rb基因編碼的蛋白質(zhì)不能與E2F結(jié)合，使其能夠不斷啟動(dòng)基因表達(dá)合成大量的DNA聚合酶，促進(jìn)細(xì)胞分裂，導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生紊亂而引起癌變[3]，因此有研究顯示許多惡性腫瘤都存在p16基因表達(dá)異常，進(jìn)一步研究還顯示p16-CyclinD-pRb通路中多種因素所導(dǎo)致E2F過度活化是腫瘤細(xì)胞周期中該通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路異常的核心機(jī)制，也是惡性腫瘤發(fā)生和演進(jìn)的重要早期分子事件[4]，提示該通路的異常在宮頸病變中也可能會(huì)發(fā)生。

2.1.3 p16基因與宮頸病變的關(guān)聯(lián)

在宮頸從正常組織進(jìn)展為癌組織的漫長(zhǎng)過程中，抑癌基因表達(dá)失活和癌基因的表達(dá)激活是其細(xì)胞癌變的分子基礎(chǔ)。在正常情況下，根據(jù)p16在細(xì)胞中的作用機(jī)制，若細(xì)胞出現(xiàn)過度生長(zhǎng)，該基因應(yīng)出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，但在對(duì)宮頸癌機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，在宮頸病變細(xì)胞中，p16基因不存在低表達(dá)或者是基因的失活現(xiàn)象，相反，pl6基因在宮頸癌組織以及高度內(nèi)皮瘤樣組織中出現(xiàn)過表達(dá)，部分研究證實(shí)，存在這種現(xiàn)象的主要原因可能是：HR-HPV E7癌蛋白可結(jié)合pRb-E2F通路中的磷酸化Rb(pRb)，使其磷酸化失活，導(dǎo)致了pRb-E2F復(fù)合物分離，游離E2F增加，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的過度增殖，同時(shí)pRb-E2F復(fù)合物的濃度持續(xù)性降低，解除了對(duì)pl6基因表達(dá)的負(fù)反饋抑制，從而導(dǎo)致了pl6基因的過表達(dá)[5,6]；因此，當(dāng)宮頸細(xì)胞化學(xué)免疫染色出現(xiàn)p16高表達(dá)，強(qiáng)烈提示宮頸已發(fā)生病變，部分研究證實(shí)，p16蛋白在子宮頸炎癥、鱗化、萎縮、不成熟化生、移行細(xì)胞化生、修復(fù)性改變等組織當(dāng)中并無陽性表達(dá)或是僅為微量表達(dá)，在纖毛細(xì)胞及未成熟鱗化細(xì)胞中意外表達(dá)；隨著宮頸病變程度的加重，p16INK4a蛋白在組織學(xué)發(fā)展過程中的陽性表達(dá)程度逐漸增強(qiáng)[7]，Tian Q等[8]研究p16INK4a在宮頸鱗癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，p16INK4a在鱗癌組織CIN中有豐富的表達(dá)，而在正常宮頸組織中不表達(dá)；Grace D等[9]在研究HR-DNA感染的宮頸鱗癌中也存在p16的過表達(dá)現(xiàn)象。

2.2 ki-67抗原分析

2.2.1 ki-67抗原特點(diǎn)

該抗原首先從淋巴瘤L428細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，1983年，由Gerdes 等人[10]在增殖細(xì)胞中對(duì)Ki-67抗原進(jìn)行鑒定，表明Ki-67抗原是一種與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)非組蛋白性核蛋白(Nonhistone nucleoprotein)，該蛋白由MKI-67基因編碼，定位于人體第10號(hào)染色體上，基因全長(zhǎng)分別為11.5 kb和12.5kb，由15個(gè)外顯子組成，ki-67蛋白組成包括兩條相對(duì)分子量分別為395 kD和345 kD的多肽鏈組成，有兩種變異體。ki-67主要維持細(xì)胞增殖，因此其Ki-67標(biāo)記指數(shù)更多被應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞狀態(tài)的監(jiān)測(cè)。

2.2.2 ki-67抗原與腫瘤的關(guān)聯(lián)

Ki-67抗原在增值活躍的細(xì)胞中全程均有表達(dá)，而在細(xì)胞靜止期不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入周期后，開始表達(dá)于Gl期，在S期及G2期表達(dá)逐漸增加，至M期達(dá)高峰，在分裂晚期很快消失[11]；作為反映腫瘤細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞周期進(jìn)行狀況的一個(gè)重要指標(biāo)，ki-67最早用于評(píng)估乳腺癌的分級(jí)與預(yù)后，后也用于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，通過計(jì)算Ki-67指數(shù)，在腫瘤細(xì)胞中，該指數(shù)越高，提示惡性程度越高，預(yù)后越差[12]；另一方面，ki-67半衰期短，在細(xì)胞分裂結(jié)束后迅速降解，但在惡性腫瘤細(xì)胞中，因其惡性增值，導(dǎo)致ki-67持續(xù)表達(dá)，使其能較好的反映腫瘤的惡性程度及患者的預(yù)后。Filippella[13]等通過研究發(fā)現(xiàn)，ki-67可很好的預(yù)測(cè)腫瘤侵襲、復(fù)發(fā)，且將腫瘤是否發(fā)生生物學(xué)改變的陽性和陰性臨界值設(shè)定為ki-67LI(ki-67 Labling index，ki-67LI)＞2.9%，可得到較高的敏感性及特異性；且在腫瘤細(xì)胞的增殖活性評(píng)估中，當(dāng)ki-67蛋白表達(dá)越高時(shí)，患者死亡風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)升高[14]。

2.2.3 ki-67抗原與宮頸病變的關(guān)聯(lián)

研究發(fā)現(xiàn)，ki-67并不直接參與宮頸癌發(fā)病的核心機(jī)制，但在對(duì)宮頸病變進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變程度加重，其檢出率越高。一項(xiàng)關(guān)于50例老年宮頸癌手術(shù)患者研究結(jié)果顯示[15]，ki-67蛋白無陰性表達(dá)，且以強(qiáng)陽性表達(dá)占比最高，其次為中等陽性、弱陽性，經(jīng)生存函數(shù)分析后發(fā)現(xiàn)，ki-67蛋白高表達(dá)患者死亡風(fēng)險(xiǎn)高，預(yù)后差，該結(jié)果與多數(shù)研究基本一致[16]，結(jié)合前面所訴，提示ki-67蛋白在宮頸病變中，隨著病變程度的加重，其表達(dá)也相應(yīng)增加，可應(yīng)于宮頸癌病變的篩查及宮頸癌手術(shù)患者預(yù)后的評(píng)估；并且研究還顯示，其高表達(dá)可能是患者不良預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

2.3 p16、ki-67聯(lián)合應(yīng)用

在我國(guó)宮頸癌篩查中，目前主要為宮頸細(xì)胞學(xué)涂片聯(lián)合HPV-DNA篩查，兩者聯(lián)合應(yīng)用部分彌補(bǔ)了細(xì)胞學(xué)涂片存在的高假陰性率及HPV-DNA檢測(cè)的高假陽性率等諸多問題，但在初篩后的分流中仍存在不能很好區(qū)分高低級(jí)別病變的弊端，導(dǎo)致患者診療過度或重視不足；而p16/ki-67雙重染色因其在宮頸癌篩查中有較好的分流作用近年來被多數(shù)學(xué)者研究。在正常細(xì)胞中，p16基因表達(dá)可以抑制細(xì)胞周期，使細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)過度分裂，而Ki-67過表達(dá)提示細(xì)胞在大量或無限增值，兩種基因過表達(dá)提示細(xì)胞完全相反的兩種生長(zhǎng)狀態(tài)，因此，不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)過表達(dá)，若p16及Ki-67基因同時(shí)過表達(dá)，強(qiáng)烈提示細(xì)胞周期失調(diào)已導(dǎo)致宮頸發(fā)生病變[17]；因此將其作為宮頸上皮細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)評(píng)估指標(biāo)，可部分彌補(bǔ)液基細(xì)胞學(xué)和HPVDNA檢測(cè)的不足；在雙重染色的發(fā)展過程中，初始是對(duì)p16表達(dá)蛋白進(jìn)行單一檢測(cè)，但在應(yīng)用過程中，一些研究顯示細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中p16INK4a非特異性染色太強(qiáng)，最高甚至可達(dá)80%以上，導(dǎo)致細(xì)胞是否發(fā)生病變難以區(qū)分，加之免疫化學(xué)染色本身也會(huì)出現(xiàn)部分假陽性及假陰性，從而限制了其臨床應(yīng)用，而Ki-67在染色上雖然誤差較小，但在計(jì)算結(jié)果方面，由于檢測(cè)方法目前尚未做到標(biāo)準(zhǔn)化，不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)、不同的實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果的一致性、可重復(fù)性較差，也部分限制了Ki67在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用；因此，部分研究學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向?qū)烧呗?lián)合應(yīng)用，多項(xiàng)研究證實(shí)了其有效性；李萱[18]等對(duì)1002名性宮頸篩查患者研究顯示：p16/ki-67單一的篩查在特異性和敏感性方面均低于聯(lián)合篩查；還有研究指出，p16對(duì)HSIL診斷敏感度、特異度雖然較高，但對(duì)LSIL行p16單獨(dú)檢測(cè)，存在漏診現(xiàn)象，建議聯(lián)合Ki-67增強(qiáng)檢出率[19]，特別是使用p16INK4a/Ki-67雙染色細(xì)胞學(xué)(CINTEC PLUS?，羅氏診斷公司)的HPV-DNA檢測(cè)和分選最近被證明是目前較為準(zhǔn)確的宮頸癌篩查算法[20]；歐洲一項(xiàng)對(duì)27349名女性行宮頸癌篩查的大型橫斷面臨床研究[21]也顯示p16/ki-67雙染檢測(cè)診斷CINII和CINIII的靈敏度均較高；而Wentzensen等人[22]對(duì)1509例HPV感染陽性的婦女進(jìn)行雙重染色的效果評(píng)估中也發(fā)現(xiàn)：雙重染色陽性率隨著細(xì)胞學(xué)嚴(yán)重程度的增加而增加；研究還顯示p16/Ki-67雙重免疫染色可能在ASC-US和低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)分診中有重要的預(yù)測(cè)作用[23]；p16/Ki-67雙染還可以檢測(cè)宮頸組織細(xì)胞的致癌變化，同時(shí)可進(jìn)行低級(jí)別病變及以下的分診[24,25]。另一方面，細(xì)胞形態(tài)學(xué)對(duì)p16/Ki-67雙染表達(dá)無影響，且操作人員主觀經(jīng)驗(yàn)對(duì)雙染結(jié)果影響較小，即使無相關(guān)經(jīng)驗(yàn)醫(yī)師在經(jīng)過培訓(xùn)后也可進(jìn)行閱片操作，Duan LF等[26]通過對(duì)902名女性進(jìn)行宮頸癌篩查，在對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判讀時(shí)顯示：兩位細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)師對(duì)p16INK4a和TCT判讀的kappa值[kappa值：即內(nèi)部一致性系數(shù)(inter-rater, Coefficient of internal consistency)，是作為評(píng)價(jià)判斷的一致性程度的重要指標(biāo)。當(dāng)計(jì)算結(jié)果在0.81～1區(qū)域時(shí)提示幾乎完全一致]的高度符合，提示p16INK4a染色結(jié)果的判讀在宮頸病變?cè)\斷和/或篩查中可以減少被病理醫(yī)生主觀因素的影響的優(yōu)勢(shì)性。美國(guó)陰道鏡及子宮頸病理協(xié)會(huì)(American Society for Coposcopy and Cervical Pathology, ASCCP)[27]將p16/ki-67雙重染色納入宮頸篩查，表明此種篩查方法有不同于其他篩查方式的優(yōu)勢(shì)及研究前景，大多數(shù)研究對(duì)于此種篩查進(jìn)行大量臨床實(shí)驗(yàn)來證明它的有效性，但大多數(shù)的研究均為小數(shù)據(jù)研究，受地域、醫(yī)療水平等限制，所得到臨床數(shù)據(jù)并不能代表我國(guó)大概的真實(shí)情況，因此該項(xiàng)篩查在實(shí)際臨床中并未得到廣泛的應(yīng)用，而且有部分專家認(rèn)為，截至目前為止，并未發(fā)現(xiàn)任何聯(lián)合標(biāo)記物較單獨(dú)使用p16能實(shí)質(zhì)提高診斷準(zhǔn)確率，僅僅在p16無法確定或技術(shù)上不充分的情況下，可考慮聯(lián)合應(yīng)用ki-67和/或Pro Exc IHC。因此，我們需要多方面綜合的查閱大量數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，從而得到一個(gè)更貼近真實(shí)情況的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探索p16/Ki-67在宮頸癌篩查方面的應(yīng)用價(jià)值。

3 p16/ki-67雙重染色在SIL中的應(yīng)用

3.1 適應(yīng)證及禁忌癥

適應(yīng)證：①HSIL(CINII/III級(jí))及良性相似病變；②可疑HSIL(CINII)或LSIL；③細(xì)胞學(xué)傾向HSIL而組織學(xué)LSIL或陰性；④HSIL鑒別診斷存在爭(zhēng)議；禁忌證：①形態(tài)學(xué)上明確的良性病變，明確的CINI、CINIII級(jí)宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變；②LSIL與宮頸良性病變的鑒別(炎癥及鱗狀上皮反應(yīng)性改變)。

3.2 p16/Ki-67雙染色報(bào)告解讀

國(guó)外學(xué)者進(jìn)行相關(guān)研究證實(shí)[28]，p16/Ki67雙重染色未經(jīng)正規(guī)細(xì)胞學(xué)形態(tài)培訓(xùn)的技術(shù)人員經(jīng)過短期的閱片培訓(xùn)等即可獨(dú)立完成閱片，并且準(zhǔn)確性和重復(fù)性都較好，盡管如此，對(duì)雙染報(bào)告的解讀仍然受其他多種因素影響，如：標(biāo)本染色效果、閱片者的學(xué)習(xí)能力及個(gè)人主觀因素等，其中p16/Ki67染色弱、細(xì)胞形態(tài)保存較差以及背景染色強(qiáng)在其中起著中起著重要作用。結(jié)果判讀如下：①陽性判讀：強(qiáng)而彌漫的塊狀染色，表現(xiàn)為連續(xù)性強(qiáng)的核/核+漿染色，且自基底層開始向上延伸至少達(dá)全層厚度的1/3；②陰性判讀：局灶或斑片狀核染色，僅胞漿表達(dá)，或僅有散在的單個(gè)細(xì)胞及其余表達(dá)方式；其中，連續(xù)塊狀染色需要足夠量的組織，鱗狀上皮好的方向性，染色陽性區(qū)需與形態(tài)懷疑處對(duì)應(yīng)；鱗狀上皮染色彌漫陽性的延伸范圍并非必須與CIN的級(jí)別對(duì)應(yīng)；以下情況：小片組織、斜切、游離漂浮的單個(gè)細(xì)胞、及其余可能導(dǎo)致更主觀及不同診斷醫(yī)師間分歧的情況，判斷為陽性的最低限度為：所有有疑問的細(xì)胞均強(qiáng)陽性，同時(shí)這些細(xì)胞形態(tài)學(xué)上已列為需與HSIL鑒別。診斷雙重染色提高診斷的準(zhǔn)確性及不同病理醫(yī)生間的一致性：使用雙重染色可導(dǎo)致約1/3CINII下調(diào)至LSIL，對(duì)形態(tài)學(xué)不確定及診斷困難的宮頸病變，尤其對(duì)局灶宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變可有輔助診斷作用；結(jié)合雙染結(jié)果，SIL的診斷：①如果染色標(biāo)本在形態(tài)學(xué)符合CINII或CINIII級(jí)，則p16陽性支持組織學(xué)HSIL診斷；②染色結(jié)果在形態(tài)學(xué)上是CIN1，即使p16陽性，也不能升級(jí)為組織學(xué)HSIL(CINII級(jí))；③極少數(shù)HSIL p16為陰性表達(dá)，準(zhǔn)確診斷必須與形態(tài)結(jié)合；④部分小片方向性差的活檢組織，即使強(qiáng)而彌漫的染色也可能難以評(píng)判為陽性。

4 p16/ki-67雙重染色方法在宮頸病變篩查或診斷的研究進(jìn)展

4.1 在ASC-US分流中的應(yīng)用

對(duì)ASC-US進(jìn)行分流是p16/Ki-67雙重染色較早用于宮頸癌篩查的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外部分學(xué)者[29]通過回顧性分析400多例ASC-US病例，將HPVE6/E7mRNA和雙重染色對(duì)宮頸可疑病變分別進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)于宮頸篩查而言，HPVE6/E7mRNA更適合用于宮頸初步篩查，宮頸發(fā)生病變初期的基因產(chǎn)物，相較于病毒DNA而言，更能排除一過性的病毒感染，雙重染色在ASC-US中的分流作用較為明顯，且能與宮頸CINII有高度的一致性，陳飛等[30]回顧性分析了200例液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(TCT) 結(jié)果為ASC-US，并行HPVE6/E7 m R NA、p16/Ki-67檢測(cè)的患者，以陰道鏡下宮頸組織活檢結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為HPVE6/E7mRNA檢測(cè)可望代替HPV-DNA 成為分流ASC-US的一種有效手段，而p16/Ki67雙重染色可輔助用于ASC-US患者宮頸組織的病理診斷。Rodens等對(duì)p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色與HC2對(duì)ASC-US和LSIL的分流能力的Meta分析其顯示對(duì)ASC-US和LSIL均有較好的分流作用。

4.2 在CIN分流中的應(yīng)用

ASCCP建議將新的分級(jí)和舊的分級(jí)聯(lián)合應(yīng)用，在新的分級(jí)中，CINII、CINIII級(jí)被歸類為HSIL，而在新的篩查指南中，HSIL需進(jìn)一步行宮頸環(huán)形電切術(shù)或?qū)m頸錐切術(shù)，但部分研究發(fā)現(xiàn)，CINII中部分為低級(jí)別病變，可消退，并不需要進(jìn)一步診治，定期隨訪即可，因此p16 /Ki67雙重染色的分流作用就顯得尤為重要。Carozzi 等[31]對(duì)宮頸HPV感染的婦女進(jìn)行分流研究發(fā)現(xiàn)，P16/ki-67染色陽性患者3年內(nèi)進(jìn)展為CINⅢ的風(fēng)險(xiǎn)為4.7%，而染色陰性的患者僅有0.8%發(fā)展為CINIII。另外，在一項(xiàng)對(duì)中國(guó)婦女中進(jìn)行的大型前瞻性研究發(fā)現(xiàn)[32]，p16INK4a在正常組織、CIN1、CIN2、CIN3、宮頸癌中的陽性率分別是2.7%、42.7%、75.5%、79.6%和100%(P＜0.001)，通過對(duì)CIN1的患者進(jìn)行p16/ki67雙重染色發(fā)現(xiàn)，與染色陰性婦女相比，雙染陽性的患者兩年后進(jìn)展為高級(jí)別病變的風(fēng)險(xiǎn)是8.25(95% CI：1.02-66.62)，表明p16、ki-67過表達(dá)不僅與宮頸病理級(jí)別相關(guān)，還可對(duì)低級(jí)別病變進(jìn)展為高級(jí)別病變的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

4.3 在HPV陽性患者的分流

Calleb George Onyango[33]等進(jìn)行了一項(xiàng)綜合性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果收集，對(duì)HPV陽性婦女進(jìn)行進(jìn)一步基于分子標(biāo)志物的篩查，以宮頸活檢結(jié)果為最終篩查結(jié)果對(duì)照，發(fā)現(xiàn)CIN2+檢測(cè)方法的診斷性能為：SCC-Ag：敏感度78.6-81.2%，特異度74-100%。M-CSF：敏感度68-87.7%，特異度64.7-94%；VEGF：敏感度56-83.5%，特異度74.6-96%。microRNA：敏感性52.9-67.3%，特異性76.4-94.4%。p16INKA/Ki-67：敏感性50～100%，特異性39～90.4%。HPVE6/E7/mRNA：敏感度為65-100%，特異度為42.7-90.2%；DNA甲基化：敏感度為59.7-92.9%，特異度為67-98%。提示將該聯(lián)合篩查作為HPV陽性的分診方法，可以在一次檢測(cè)陽性后即轉(zhuǎn)診陰道鏡+宮頸活檢；直接接受后續(xù)的檢查和治療。Li[34]等通過對(duì)21～70 歲參加宮頸癌篩查的婦女及門診患者共計(jì)497例進(jìn)行 HPV E6/E7m RNA 檢測(cè)、液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)(LBC)與 p16/Ki67 雙染對(duì)比分析認(rèn)為，p16/Ki67雙染技術(shù)用于HPV陽性人群的分流具有優(yōu)于LBC的特異性和與LBC檢測(cè)相似靈敏度的特性。Luttmer R等[35]也表明 p16/Ki -67雙染能有效提高 CIN≥III 級(jí)病變?cè)\斷敏感度、特異度，被認(rèn)為是高危型HPV陽性女性分流手段。綜合以上研究不難發(fā)現(xiàn)，對(duì)于HPV陽性分流的應(yīng)用大部分研究仍是基于HPV聯(lián)合TCT初篩為基礎(chǔ)的二次分流，而不是將雙重染色用于宮頸癌的初篩，該雙染在篩查中的應(yīng)用仍主要用于宮頸上皮內(nèi)瘤變的分流[36]。

4.4 在宮頸癌治療和評(píng)估的應(yīng)用

近十年對(duì)于p16/Ki67雙染的研究，主要是將該篩查用于ASCUS的診斷分流，但隨著后續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)該染色在宮頸病變CINII及宮頸癌預(yù)后評(píng)估中也發(fā)揮重要作用。徐又先等在關(guān)于宮頸癌的研究中將ki-67與hmsh2聯(lián)合應(yīng)用于宮頸癌預(yù)后表達(dá)的研究，結(jié)果表明，在宮頸癌組織中，ki-67的陽性率顯著升高，且hM-SH2在Ki-67高度表達(dá)者陽性率顯著高于Ki-67中度表達(dá)者，提示hM-SH2與 Ki-67表達(dá)的相關(guān)性，hMSH 2陽性表達(dá)伴有Ki-67過表達(dá)者，其癌細(xì)胞增殖活躍，更易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。雖然根據(jù)此研究結(jié)果我們并不能看出ki-67在宮頸癌中的具體機(jī)制及與hMSH 2相關(guān)聯(lián)程度，但其在宮頸癌的篩查及預(yù)后評(píng)估中應(yīng)用價(jià)值卻值得我們進(jìn)一步研究，而與p16的聯(lián)合應(yīng)用，將使它的應(yīng)用價(jià)值又進(jìn)一步增加。GuanFY等[37]最新研究，將P16/ki-67雙重染色和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)及其聯(lián)合應(yīng)用在低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變細(xì)胞學(xué)分流診斷中的價(jià)值中發(fā)現(xiàn)，該雙重染色還可應(yīng)用于宮頸癌治療效果及預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。

5 展望

子宮頸癌作為最常見的婦科惡性腫瘤之一，其致病機(jī)制是一個(gè)多因素、多步驟、多階段、多種癌基因和抑癌基因參與的復(fù)雜病理過程，目前病因較為明確，且通過三階梯篩查可檢測(cè)出宮頸癌前病變。但在宮頸上皮內(nèi)瘤變轉(zhuǎn)歸的評(píng)估中，一個(gè)最重要的問題就是預(yù)測(cè)病變是否有進(jìn)一步轉(zhuǎn)化惡性的高危風(fēng)險(xiǎn)，以避免不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診，并降低醫(yī)療保健成本。目前各種基于HR-HPV的篩查項(xiàng)目考慮的方法多種多樣，證明了圍繞最佳分診測(cè)試缺乏共識(shí)，而積極尋找最佳的篩查和診斷方法，是我們應(yīng)該積極探索和追求的。p16/ki67雙重染色包括細(xì)胞學(xué)染色及組織學(xué)染色，目前主要在宮頸病變分流中被應(yīng)用，前者包括對(duì)ASCUS及HPV陽性的分流，后者則對(duì)陰道鏡活檢后對(duì)CIN病變分級(jí)不確定的患者進(jìn)行分流，在臨床實(shí)際中，雙重染色的應(yīng)用雖已有許多臨床數(shù)據(jù)表明其有效性，但在臨床實(shí)際應(yīng)用中仍然缺乏廣泛認(rèn)可，染色的應(yīng)用范圍及普及性仍不確切，需要更多的臨床隨機(jī)對(duì)照研究來證明其實(shí)用性，且部分研究還顯示其在宮頸癌治療及預(yù)后評(píng)估方面也有一定指示作用，因此研究p16/ki-67雙重染色檢測(cè)，可以為宮頸癌預(yù)測(cè)和評(píng)估提供更加確切的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。