九寨溝地震不同受損程度云杉林土壤微生物豐度差異

張煒, 趙福培, 賀維, 吳世磊, 蘇宇, 陳滌非, 鄢武先, 鄧東周, 黃春萍, 陳永林

1. 四川省林業(yè)科學(xué)研究院，森林和濕地生態(tài)恢復(fù)與保育四川省重點實驗室，四川 成都 610000；

2. 四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610000；

3. 九寨溝縣林業(yè)和草業(yè)局，四川 阿壩 623400

九寨溝國家級自然保護區(qū)位于中國西南部的四川省，處于濕潤的四川盆地邊緣向半干旱的青藏高原延伸的過渡地帶。它是聯(lián)合國列入的世界自然遺產(chǎn)和人與生物圈保護區(qū)[1]。九寨溝作為世界生物多樣性熱點之一，具有保護全球生物多樣性的意義和研究價值[2]。2017 年四川省阿壩藏族羌族自治州九寨溝縣發(fā)生7.0 級地震，這次地震使得林地資源和野生動物棲息地遭到了嚴(yán)重?fù)p毀，區(qū)域內(nèi)局部范圍的生態(tài)系統(tǒng)功能衰退，區(qū)域生態(tài)狀況急劇惡化，大熊貓等珍稀野生動物生命安全受到極大威脅。地震導(dǎo)致山體滑坡、泥石流等自然災(zāi)害，進(jìn)一步造成森林植被受到巨大破壞[1,3]。因此，加速地震災(zāi)區(qū)的森林生態(tài)修復(fù)，對保障該區(qū)域生態(tài)安全、構(gòu)筑生態(tài)屏障具有重要現(xiàn)實意義。

土壤微生物是森林生態(tài)系統(tǒng)不可缺少的重要組成部分，在生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)、凋落物分解、土壤肥力的形成與維持、碳氮周轉(zhuǎn)等方面具有不可替代的作用[4,5]。土壤微生物是對環(huán)境變化最敏感的生物指標(biāo)，是比土壤有機質(zhì)更可靠的環(huán)境變化指標(biāo)[6]。微生物在森林土壤環(huán)境中占有十分重要的位置，量化土壤微生物對于掌握地震災(zāi)區(qū)森林土壤微生物現(xiàn)狀具有十分重要的意義。本研究采用實時熒光定量PCR 的方法對九寨溝典型受災(zāi)區(qū)不同受損程度粗枝云杉（Piceaasperata）林土壤微生物豐度進(jìn)行調(diào)查分析，探討地震對九寨溝粗枝云杉林微生物及其與土壤理化因子之間的相關(guān)性，為震后森林土壤生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)、重建和協(xié)調(diào)提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)域九寨溝國家級自然保護區(qū)，位于青藏高原東緣（E103°46′—104°05′，N32°55′—33°16′；1 996?4 764 m a.s.l.）。受熱帶和海洋性季風(fēng)氣候影響，經(jīng)常暴露在亞冰點溫度下，年平均溫度為6 ℃?7 ℃，最高溫度和最低溫度分別為30.7 ℃和?20.2 ℃。年平均降水量約761.8 mm，大部分降水量在5 月至8 月之間。從10 月到次年4 月下旬為雪被期。區(qū)域內(nèi)植被豐富，有冷杉（Abies ernestii）、落葉松（Laris potaninii）、華山松（Pinus armandii）、油松（Pinus tabulaeformis）等，林下植被以高山柳（Salixcupularis）、繡線菊（Spiraea salicifolia）等為主[7]。

2 研究方法

2.1 樣地設(shè)置

研究地段位于九寨溝在地震中受到嚴(yán)重影響的典型粗枝云杉林，土體有翻動、崩塌、滑坡等現(xiàn)象。在林內(nèi)分別選擇受損嚴(yán)重、受損中等及受損較輕的3 個取樣樣地，編號分別為D1、D2 和D3，同時選擇沒有明顯的斷裂、顛覆和滑坡等土地破壞現(xiàn)象，土體及土表植被相對完整的土壤作為對照，編號CK。樣地具體情況見表1。

表 1 樣地信息Tab. 1 Basic information of studied sites

2.2 樣品采集

在4 個對比研究點，分別隨機選取3 個20 m×20 m的樣地作為重復(fù)采樣點。采用5 點法，在每個重復(fù)采樣點采集0?30 cm 土樣5 份，并去除枯枝落葉等，然后將5 點土樣混合均勻后裝入袋子。分別于2019 年4 月6 日（春 季）、6 月12 日（夏 季）、9 月25 日（秋季）和12 月2 日（冬季）采集土壤樣品。樣品儲存在冷凍箱中，并在24 小時內(nèi)運送至實驗室。每個樣本分成兩份，一份使用真空冷凍干燥機在?80 °C 下冷凍干燥（Wizard2.0，VirTis USA），供土壤DNA 提取和微生物豐度檢測使用。另一份在65 °C 下烘箱干燥72 小時，然后分析以確定質(zhì)量（quantity）（表2）。

2.3 微生物豐度檢測

凍干土壤樣品的基因組DNA 均采用北京天恩澤基因科技有限公司的Soil DNA out 試劑盒并按操作說明提取。并采用天根生化科技（北京）有限公司Universal DNA Purification Kit 試劑盒純化所有的樣品DNA，純化步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳回收純化后的總DNA 10-100 ng 作模板，在Bio-Rad iCycle PCR 儀中進(jìn)行PCR 擴增反應(yīng)。采用338f：5′-(GC)-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′和518r：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′擴增細(xì)菌16S rRNA 基因。采用U1：5′-(GC)-GTGAAATTGTT GAAAGGGAA-3′和U2：5′-GACTCCTTGGTCCGTG TT-3′擴增真菌18S rRNA 基因[8,9]。選擇凝膠上的條帶進(jìn)行切膠回收和擴增，擴增產(chǎn)物純化后，連接到pMD19-T 載體（TaKaRa）相連，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α在培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將獲得陽性克隆。選擇陽性克隆并提取質(zhì)粒供qPCR 反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線使用，質(zhì)粒濃度采用ScanDrop100 超微量核酸蛋白測定儀（Analytik Jena，德國）測定，然后分別進(jìn)行10 倍梯度系列稀釋以作為定量PCR 擴增的標(biāo)準(zhǔn)品在Mini-Opticon Real-Time system (Bio-Rad, USA)上進(jìn)行擴增，根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出樣品中的基因拷貝數(shù)，最后以每克樣品(干重)的基因拷貝數(shù)為單位進(jìn)行分析。PCR 反應(yīng)效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為：細(xì)菌107.5%和r2=0.998，真菌98.3%和r2=0.997。

表 2 不同采樣點理化特征Tab. 2 Physical and chemical characteristics of different sampling sites

2.4 數(shù)據(jù)處理

實時熒光定量PCR 擴增得到的不同微生物基因拷貝數(shù)經(jīng)過Ln 對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計分析，用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用最小顯著差異法（LSD）。微生物基因豐度與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系采用Pearson 法分析。數(shù)據(jù)整理、計算與作圖均采用Microsoft Excel 2013軟件。

3 研究結(jié)果

3.1 不同損毀地微生物的季節(jié)性變化特征

受地震災(zāi)害影響各林地土壤細(xì)菌16S rDNA 和真菌18S rDNA 基因檢測結(jié)果見圖1。如圖1，受災(zāi)地森林土壤細(xì)菌16S rDNA 基因拷貝數(shù)范圍為4.39×108?9.58×108copies/g 干土。在相同的采樣季節(jié)，不同損毀地土壤細(xì)菌16S rDNA 豐度無顯著差異（P＞0.05）。春季和夏季，CK 土壤細(xì)菌16S rDNA 豐度最高，D3 次之；而秋季和冬季，D3 細(xì)菌16S rDNA 基因豐度最高，CK 次之。各損毀林地土壤細(xì)菌16S rDNA豐度隨時間變化波動較大，表現(xiàn)相似的季節(jié)性變化特征。全年各林地細(xì)菌16S rDAN 基因豐度春季最低，從春季到夏季顯著增長（P＜0.05），達(dá)到全年最高值，從夏季到冬季又顯著降低（P＜0.05）。

在相同采樣季節(jié)，各損毀地土壤真菌18S rDNA豐度也無顯著的差異性（P＞0.05），基因拷貝數(shù)范圍為1.58×106?2.09×106copies/g 干土(見圖1b)。各損毀地土壤真菌18S rDNA 豐度季節(jié)性變化相似，但與細(xì)菌16S rDAN 基因不同，且波動不大。全年各采樣點真菌18S rDNA 豐度從春季到夏季略有降低，但不顯著（P＞0.05），從夏季到秋冬季又逐漸增加，也不顯著（P＞0.05）。

3.2 微生物豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性

采用SPSS 19.0 軟件對各損毀林地土壤中的微生物豐度與相應(yīng)的環(huán)境因子進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果見表3，由表3 可知，CK 土壤細(xì)菌16S rDNA基因豐度與土壤pH 值（R=?0.617）呈顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），與土壤總孔隙度（R=0.884）和總氮（R=0.713）分別呈極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01）。D1 土壤細(xì)菌16S rDNA 基因豐度與土壤pH 值（R=?0.796）呈極顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.01），與土壤容重（R=?0.610）呈顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），并與土壤總孔隙度（R=0.733）和總氮（R=0.585）分別呈極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01）和顯著的正相關(guān)性（P＜0.05）。D2 土壤細(xì)菌16S rDNA 基因豐度與土壤總孔隙度（R=0.612）和總氮（R=0.838）分別呈顯著的正相關(guān)性（P＜0.05）和極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01）；D3 土壤細(xì)菌16S rDNA 基因豐度則與土壤總孔隙度（R=0.746）和總氮（R=0.779）分別呈極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01）。D1 土壤真菌18S rDNA基因豐度與土壤有機碳（R=0.705）呈顯著的正相關(guān)性（P＜0.05），而D2、D3 和CK 的土壤真菌18S rDNA基因豐度與所檢測的環(huán)境因子之間相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）。

圖 1 地震損毀林土壤在2019 年4 月（春季）、2019 年6 月（夏季）、2019 年9 月（秋季）、2019 年12 月（冬季）細(xì)菌（1）和真菌（2）rDNA 基因的豐度Fig. 1 The abundance of bacterial (1) and fungal (2) rDNA genes in forest soils damaged by earthquake in April (spring), June (summer),September (autumn), and December (winter) of 2019

4 討論

4.1 微生物豐度的季節(jié)性變化

微生物rDNA 基因的季節(jié)性變化結(jié)果表明，九寨溝粗枝云杉人林受地震不同損毀地土壤細(xì)菌和真菌rDNA 基因豐度均具有明顯的動態(tài)特征（見圖3）。與地震前其他高海拔生態(tài)環(huán)境中的研究結(jié)構(gòu)相同，季節(jié)性變化對微生物的影響具有明顯的階段性特征，亞高山/高山森林的微生物群落從冬季到夏季可能會增加[10-12]，本研究中各損毀林地土壤細(xì)菌從春季到夏季表現(xiàn)為顯著增長，到秋冬季節(jié)又顯著降低，且冬季高于春季。而與此相反，真菌則是從春季到夏季表現(xiàn)為降低趨勢，夏季到秋冬季節(jié)又緩慢增長。這些結(jié)果都反映了高寒森林季節(jié)性變換對微生物產(chǎn)生的不同影響，而且由于人工林不同的發(fā)育階段所代表的區(qū)域性環(huán)境因子對微生物也產(chǎn)生了不同的影響。春季充沛的降雨和土壤凍融帶來的融雪可能引起細(xì)胞內(nèi)外水勢的嚴(yán)重失衡[13]，從而導(dǎo)致微生物，尤其是細(xì)菌的死亡。由于對低溫具有較強的耐受性，以及菌絲體和孢子的形成，大多數(shù)真菌能適應(yīng)土壤凍融過程中快速變化的極端條件，因此真菌豐度隨季節(jié)性的變化幅度沒有細(xì)菌劇烈。另外，由于高山森林凋落物的年峰值一般出現(xiàn)在深秋和初冬，新鮮凋落物相對容易分解[14]，豐富的凋落物增加了大量微生物胞外酶的產(chǎn)生[15,16]。當(dāng)冬季積雪覆蓋時，相對穩(wěn)定的環(huán)境也有助于維持微生物活性，促進(jìn)有機質(zhì)分解，平衡土壤水分，因此秋冬季節(jié)微生物豐度維持在比春季更高的水平。

表 3 各位點微生物基因豐度與環(huán)境因子之間的相關(guān)性分析Tab. 3 Pearson’s correlation analyses between soil microbial gene abundance and environmental variables at each sampling site

4.2 不同地震損毀程度林地微生物豐度差異

由于地震對土壤和森林植被的破壞造成了土壤養(yǎng)分的明顯下降，土壤黏粒的迅速流失，使土壤微生物失去了繁育生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生存載體[17]。土壤微生物對外界環(huán)境的變化又十分敏感，這就導(dǎo)致了土壤微生物豐度的下降。由于地震破壞程度的不同，林地土壤中資源的可利用性差異也不相同，不同損毀地微生物下降的趨勢也就表現(xiàn)相應(yīng)的差異。受損較輕的D3 林地較受損嚴(yán)重的D2 和D3 林地，植被覆蓋和生物量相對較高，微生物的生存空間更大，食物來源更廣，微生物的生長繁殖優(yōu)勢相對也就更大，因此表現(xiàn)為豐度降低程度相對較小。

研究發(fā)現(xiàn)土壤理化指標(biāo)和微生物豐度受地震影響明顯下降，而且在不同損毀地表現(xiàn)出一定的影響差異。微生物的生長活性常常受氮有效性的限制，環(huán)境中氮有效性越高，微生物的活性越強，繁殖也越快[18]。在不同損毀林地細(xì)菌豐度均與土壤總氮呈顯著或極顯著的正相關(guān)性，充分表明了，地震帶來的土壤氮素的流失可能是引起土壤微生物豐度變化的重要因素。另一個重要的因素是土壤總孔隙度，它對各損毀林地的影響都顯著。土壤孔隙結(jié)構(gòu)在土壤中的分布呈現(xiàn)出高度的異質(zhì)性，并且極易受周圍環(huán)境的影響，能及時反映土壤涵養(yǎng)水源、吸持水分及保障氣體暢通能力。同時土壤孔隙特征是影響微生物功能、活性和異質(zhì)性的主要因素[19]。地震對土壤總孔隙度造成不同程度的嚴(yán)重影響[20]，使土壤總孔隙度顯著降低，隨之表現(xiàn)為土壤微生物相應(yīng)的顯著降低。

綜上所述，受地震災(zāi)害影響九寨溝粗枝云杉林土壤細(xì)菌16S rDNA 和真菌18S rDNA 基因豐度均有不同程度的降低；與相似生境研究結(jié)果一致，微生物豐度的變化具有明顯的季節(jié)性特征，但細(xì)菌和真菌豐度的變化趨勢不同。各林地土壤微生物豐度受到環(huán)境因子的影響，其中土壤pH 值、土壤總孔隙度、土壤總氮、土壤容重對土壤微生物產(chǎn)生的影響更深刻。