水產(chǎn)品中食源性病原菌多重PCR快速檢測(cè)方法的建立

母潤(rùn)紅，聶丹丹，李明成，馬 麗，趙 明，高麗君，劉曉蓉

(1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.長(zhǎng)春海關(guān)技術(shù)中心，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)結(jié)果[1]顯示：每年大約有60%～70%食源性疾病是由食源性病原體引起的，并且食物中毒人數(shù)逐年增多，因此，食品安全是迫切需要解決的問(wèn)題.水產(chǎn)品在捕撈、儲(chǔ)藏、加工、運(yùn)輸過(guò)程中等易受到病原微生物的污染，水產(chǎn)品中食源性病原菌的準(zhǔn)確、快速檢測(cè)是保證其食品安全的首要措施.建立針對(duì)水產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌、單細(xì)胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和霍亂弧菌4種食源性致病菌的快速檢測(cè)方法，對(duì)我國(guó)食品安全具有保障作用.細(xì)菌性病原體傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有細(xì)菌培養(yǎng)周期長(zhǎng)、操作步驟繁瑣、耗時(shí)等缺點(diǎn)，很難滿(mǎn)足食源性病原體快速檢測(cè)的需求[2].多重PCR檢測(cè)技術(shù)具有高效、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，利用分子生物學(xué)技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多種致病菌，節(jié)約時(shí)間，提高效率，已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)[3-5].目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)多種食源性致病菌的多重PCR檢測(cè)方法也有報(bào)道，但針對(duì)同時(shí)鑒定水產(chǎn)品中4種病原菌的多重PCR研究鮮有報(bào)道.

本試驗(yàn)對(duì)設(shè)計(jì)特異性引物和多重PCR退火溫度反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，以探索能同時(shí)檢測(cè)沙門(mén)氏菌、單細(xì)胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和霍亂弧菌的多重PCR技術(shù)，為水產(chǎn)品中病原菌的快速檢測(cè)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

目標(biāo)菌株：沙門(mén)氏菌(ATCC 12011)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(ATCC 19111)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、霍亂弧菌(JL.08108).非目標(biāo)菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC 12600)、豬霍亂沙門(mén)氏菌(ATCC 13311)、李斯特菌(ATCC 19119)、普通變形桿菌(ATCC 33420)、小腸耶爾森菌(ATCC 23715)、大腸埃希氏菌(ATCC 11229)、克雷伯氏菌(ATCC 43086)、糞腸球菌(ATCC 14500)、蠟樣芽孢桿菌(ATCC 11176)、志賀氏菌(JL08036)和陰溝腸桿菌(ATCC10146)(長(zhǎng)春海關(guān)技術(shù)中心)；天根細(xì)菌DNA 提取試劑盒、10×Buffer和DL2000 DNA Marker(TaKaRa 公司，日本)；核酸檢測(cè)儀和高速離心機(jī)(Sigma 公司，美國(guó)).

1.2 引物設(shè)計(jì)合成及DNA提取

選擇沙門(mén)氏菌的侵襲蛋白基因invA、單核細(xì)胞增生李斯特菌prfA、副溶血性弧菌tlh和霍亂弧菌ompW4為靶基因，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件按照多重PCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)4對(duì)引物.見(jiàn)表1.各引物均由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成.目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌均采用LB液體肉湯培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)18 h，震蕩培養(yǎng)，取1 mL菌液，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒要求進(jìn)行提取，將提取的DNA作為模板，-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.3 單重PCR擴(kuò)增及敏感性試驗(yàn)

應(yīng)用超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000 測(cè)定已提取的目標(biāo)菌沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌和霍亂弧菌基因組的DNA濃度，用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行系列10倍梯度稀釋?zhuān)?09～100cfu/mL為模板，進(jìn)行靶基因invA、prfA、tlh和ompW的單重PCR擴(kuò)增和敏感性檢測(cè).單重PCR反應(yīng)體系25 μL：2×Taq Master Mix 12.5 μL，引物濃度為0.5 μmol/L，模板 2 μL，蒸餾水 10 μL，退火溫度58 ℃ 48 s，取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物觀察分析目的條帶大小和最低限度檢測(cè)值.

1.4 多重PCR退火溫度優(yōu)化

設(shè)計(jì)溫度梯度PCR擴(kuò)增程序，退火溫度依次為52、54、56、58、60 ℃，篩選出最適宜的退火溫度.

表1 引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Tab.1 Primer sequence and amplified fragment length

1.5 多重PCR特異性試驗(yàn)

以金黃色葡萄球菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、李斯特菌、普通變形桿菌、小腸耶爾森菌、大腸埃希氏菌、克雷伯氏菌、糞腸球菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、陰溝腸桿菌的DNA及4種目標(biāo)菌的混合基因組DNA為模板，采用退火溫度優(yōu)化后的多重PCR進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證引物的特異性.

1.6 多重PCR敏感性試驗(yàn)

應(yīng)用超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000 測(cè)定4種病原菌基因組 DNA濃度，用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行系列10倍梯度稀釋?zhuān)?09～100cfu/mL為模板，取1 mL各濃度菌液提取基因組DNA，進(jìn)行多重PCR敏感性試驗(yàn).

1.7 多重PCR對(duì)人工污染的魷魚(yú)檢驗(yàn)試驗(yàn)

應(yīng)用建立的多重PCR對(duì)人工污染魷魚(yú)進(jìn)行檢測(cè).具體方法：20 g魷魚(yú)樣品，置于200 mL LB肉湯液體培養(yǎng)基中，36 ℃震蕩培養(yǎng)18 h，采用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取DNA作為模板，添加4種目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌進(jìn)行樣品特異性檢測(cè).

2 結(jié) 果

2.1 單重PCR擴(kuò)增及敏感性檢測(cè)結(jié)果

將4種目的菌株模板進(jìn)行單重 PCR 特異性擴(kuò)增及靈敏度檢測(cè).結(jié)果顯示：沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌均能擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)大小目的片段，invA基因結(jié)果擴(kuò)增出特異性片段為198 bp，tlh為450 bp，ompW為588 bp，prfA為274 bp.同時(shí)檢測(cè)出沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌和霍亂弧菌最低檢測(cè)極限為1×104cfu/mL，僅單核細(xì)胞增生李斯特氏菌最低檢測(cè)極限為1×107cfu/mL，表明單重PCR檢測(cè)方法具有較高的檢測(cè)靈敏度.見(jiàn)圖1.

2.2 多重PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果

由圖2可以看出：退火溫度對(duì)多重PCR擴(kuò)增效果的影響很明顯，退火溫度在52～58 ℃時(shí)均能擴(kuò)增出4條清晰的目的條帶；但溫度在60 ℃時(shí)，沙門(mén)氏菌未能擴(kuò)增出目的片段，其中以退火溫度為54 ℃(泳道2)時(shí)各菌株目的基因的擴(kuò)增效率稍高，且較均衡，故選擇54 ℃為該多重PCR的最佳退火溫度.優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系：模板DNA 8 μL(各個(gè)菌DNA模板各2 μL)，4種引物各2 μL，2×Taq Master Mix 14.5 μL，總體積45 μL.退火溫度54 ℃ 45 s.結(jié)束反應(yīng)，4 ℃保存，30 min后通過(guò)瓊脂糖凝膠紫外成像分析系統(tǒng)記錄并保存.

2.3 多重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系通過(guò)單管多重PCR檢測(cè)4株目的菌特異性，每管加入4種、3種、2種和1種混合基因組DNA，均能擴(kuò)增出特異性目的片段.見(jiàn)圖3.

2.4 多重PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

采用無(wú)菌生理鹽水系列 10 倍梯度稀釋(109～104cfu/mL)4株目的菌DNA作為模板，進(jìn)行多重 PCR 靈敏度檢測(cè).結(jié)果顯示：建立的多重PCR方法最低檢測(cè)極限為1×104cfu/mL，表明多重PCR 檢測(cè)方法具有較高的檢測(cè)靈敏度.見(jiàn)圖4.

2.5 多重PCR對(duì)人工污染的魷魚(yú)檢驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用優(yōu)化后的多重PCR技術(shù)對(duì)人工污染魷魚(yú)的9株非目標(biāo)菌株基因組DNA及4種目標(biāo)菌的混合基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：沙門(mén)氏菌在198 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增片段，單增李斯特菌在274 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增片段，副溶血性弧菌在450 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增片段，霍亂弧菌在588 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增片段，且4種目的菌株條帶清晰，無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶；而非目的菌株的基因組DNA均未擴(kuò)增出任何條帶，表明這4對(duì)引物無(wú)相互干擾且特異性較好，由此表明建立的多重PCR可用于同時(shí)檢測(cè)1種或4種致病菌.見(jiàn)圖5.

3 結(jié) 論

食源性細(xì)菌性病原菌引發(fā)的食源性疾病對(duì)人們的生活造成了嚴(yán)重影響[6-7]，進(jìn)口食品也存在此類(lèi)風(fēng)險(xiǎn).近年來(lái)，我國(guó)在食品安全標(biāo)準(zhǔn)、技術(shù)水平、設(shè)備設(shè)施建設(shè)方面做出了相應(yīng)改革，進(jìn)出口食品檢驗(yàn)檢疫要求也更加嚴(yán)格[8]，并向著制度化、體系化方向發(fā)展.因此，我國(guó)在食品安全方面采用先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)更為重要.

多重PCR(multiplex PCR，mPCR)反應(yīng)技術(shù)是以單一PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)，在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行兩種以上的特異性PCR擴(kuò)增技術(shù)，整個(gè)試驗(yàn)操作過(guò)程與常規(guī)PCR反應(yīng)技術(shù)相同，其優(yōu)點(diǎn)是在相同的時(shí)間里，一個(gè)反應(yīng)體系可以檢測(cè)出多種病原體，并實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的放大化[9-11].

本試驗(yàn)將4種標(biāo)準(zhǔn)株沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌和霍亂弧菌特異靶基因invA、prfA、tlh和ompW作為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)特異性引物，分別對(duì)4種菌特異性引物進(jìn)行篩選，選擇適宜的特異性引物，篩選單重PCR擴(kuò)增條件.影響多重PCR擴(kuò)增因素較多，將單重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，探索多重PCR退火溫度，以建立多重PCR檢測(cè)方法.通過(guò)檢測(cè)4株目的菌珠的特異性、敏感性及人工污染魷魚(yú)檢驗(yàn)的結(jié)果表明：所建立的多重PCR敏感性最低檢測(cè)值為1×104cfu/mL，具有較好的靈敏性.選取9株非目的菌珠和4株目的菌株通過(guò)LB液體培養(yǎng)后，采用細(xì)菌基因組試劑盒提取基因組，設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)行特異性檢測(cè).本試驗(yàn)結(jié)果顯示：目的菌珠均能擴(kuò)增出大小相同的基因片段，非目的菌珠未見(jiàn)條帶，而且無(wú)交叉反應(yīng)出現(xiàn)，表明該方法的特異性高，方法具有可信性.人工添加目的菌的魷魚(yú)也能擴(kuò)增出大小相同的目的菌株片段，表明此方法可用于水產(chǎn)品檢測(cè).因此，本試驗(yàn)建立了多重PCR方法可用于食源性細(xì)菌性病原菌的檢測(cè).

本試驗(yàn)建立的多重PCR方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于食源性細(xì)菌性病原體的檢測(cè)，為我國(guó)的食品安全提供可靠保障.